Summary

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي

Published: August 09, 2013
doi:

Summary

يصف هذا الأسلوب استخدام الكيمياء فوق لقياس التغيرات في النسخ الخلية المضيفة بعد الإصابة مع بفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV) سلالة MP-12. النتائج يمكن تصور نوعيا عبر المجهر مضان أو التي تم الحصول عليها من الناحية الكمية من خلال التدفق الخلوي. هذه الطريقة غير قابلة للتكيف للاستخدام مع الفيروسات الأخرى.

Abstract

وقد تطورت العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي القدرة على منع النسخ الخلية المضيفة كوسيلة للتحايل على الدفاعات الخلوية. لدراسة هذه الفيروسات، ولذلك فمن المهم أن يكون هناك طريقة سريعة وموثوق بها لقياس النشاط النسخي في الخلايا المصابة. تقليديا، وقد تم قياس النسخ إما عن طريق إدماج نوكليوسدس المشعة مثل H-3 يوريدين تليها كشف عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي أو التلألؤ العد، أو إدماج المهلجنة النظير يوريدين مثل 5 bromouridine (برو)، يليه كشف عبر المناعية. استخدام النظائر المشعة، ومع ذلك، يتطلب معدات متخصصة وغير مجدية في عدد من بيئة معملية، في حين كشف برو يمكن أن تكون مرهقة، وربما يعانون من حساسية منخفضة.

وضعت مؤخرا ضغطة والكيمياء، والذي ينطوي على تشكيل الترايازول النحاس المحفزة من أزيد وآلكاين، والآن يوفر سريعة وHIGHLY بديلة حساسة لهاتين الطريقتين. اضغط الكيمياء هي عملية من خطوتين التي وصفت أول الحمض النووي الريبي الوليدة عن طريق إدماج يوريدين التناظرية 5 ethynyluridine (الاتحاد الأوروبي)، ثم من خلال الكشف عن التسمية مع أزيد الفلورسنت. كما تتوفر العديد من fluorophores مختلفة هذه azides، مما يسمح لمجموعة واسعة من الخيارات لالتصور.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس قمع النسخي في الخلايا المصابة مع بفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV) سلالة MP-12 باستخدام الكيمياء فوق. وفي الوقت نفسه، يتم تحديد التعبير عن البروتينات الفيروسية في هذه الخلايا المناعية من قبل الخلايا الكلاسيكية. الخطوات من 1 إلى 4 بالتفصيل طريقة لتصور قمع النسخي عبر المجهر مضان، بينما الخطوات من 5 إلى 8 بالتفصيل طريقة لقياس قمع النسخي عبر التدفق الخلوي. هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة للاستخدام مع الفيروسات الأخرى.

Introduction

تقليديا، وقد تم قياس النشاط النسخي من خلال إدماج إما المشعة (3 H-يوريدين) 1 أو المهلجنة (برو) 2 نوكليوسدس في الحمض النووي الريبي الوليدة. وتؤخذ هذه يوريدين النظير من قبل الخلايا، وتحويلها إلى يوريدين-ثلاثي الفوسفات (UTP) من خلال مسار الإنقاذ نوكليوزيد، وتدرج لاحقا في تصنيعه حديثا RNA. 3 H-يوريدين يمكن الكشف عنها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي، الذي يمكن أن يكون مضيعة للوقت، أو التلألؤ عد، الأمر الذي يتطلب معدات متخصصة. وعلاوة على ذلك، واستخدام النظائر المشعة قد لا يكون من العملي في عدد من بيئة معملية، بما في ذلك ارتفاع معامل الاحتواء السلامة الأحيائية. ويمكن الكشف عن برو من خلال المناعية مع الأجسام المضادة المقاومة للبرو، والتي قد تتطلب permeabilization قاسية لضمان وصول الأجسام المضادة للنواة أو تمسخ جزئي من الحمض النووي الريبي، وبنية الحمض النووي الريبي الثانوية قد يكون عائقا الفراغية للربط الأجسام المضادة.

_content "> بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم يعتمد ضعت مؤخرا الكيمياء فوق 3 لقياس النشاط النسخي في الخلايا المصابة مع سلالة RVFV MP-12. اضغط الكيمياء على النحاس انتقائية للغاية وفعالة (I) المحفزة رد فعل الاضافه الحلقيه بين آلكاين و وشاردة أزيد 4،5. في هذا البروتوكول، هو المسمى الحمض النووي الريبي الوليدة في الخلايا المصابة أولا من خلال إدماج يوريدين التناظرية الاتحاد الأوروبي. وفي الخطوة الثانية، يتم الكشف عن الاتحاد الأوروبي أدرجت خلال تفاعل مع أزيد الفلورسنت. المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هي: (1) أنه لا تتطلب استخدام النظائر المشعة و (2) أنها لا تتطلب permeabilization القاسية أو تمسخ من الحمض النووي الريبي. ذات وزن جزيئي أقل من 50 دا، والوصول إلى أزيد من الفلورسنت لا يعوقه عدم كفاية permeabilization أو RNA هيكل الثانوي. وعلاوة على ذلك، فإن الباحثين لا تقتصر في اختيارهم من الأجسام المضادة الأولية عند الجمع بين الكشف عن الحمض النووي الريبي مع فئةالمناعية كال للبروتينات الفيروسية.

ووصف اثنان من طرق مختلفة في هذا البروتوكول: واحدة لتصور النسخ عن طريق الفحص المجهري مضان (الخطوات 1-4)، واحدة لقياس النسخ من خلال التدفق الخلوي (الخطوات 5-8). كل من هذه الأساليب الجمع بين وضع العلامات من الحمض النووي الريبي الوليدة مع الخلايا المناعية لبروتينات فيروسية، والذي يسمح للعلاقة بين النشاط النسخي والعدوى الفيروسية على أساس خلية تلو خلية.

وقد استخدمت بنجاح من الكتاب بروتوكول الموصوفة هنا لتحديد النشاط النسخي في الخلايا المصابة مع سلالة RVFV MP-12 الخلايا المصابة مع مختلف MP-12 المسوخ 7،8، 9، والخلايا المصابة مع فيروس توسكانا (TOSV) 10. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام مع انواع مختلفة من الفيروسات وديه القدرة على تعديلها لتشمل تلوين المناعي من البروتينات الفيروسية أو الخلوية محددة.

Protocol

تحليل النسخ بواسطة المجهر مضان 1. تصيب الخلايا مع MP-12 وتسمية الحمض النووي الريبي الوليدة مع الاتحاد الأوروبي مكان coverslips على مدار 12 ملم إلى 12 جيدا نسيج لوحة الثقافة، ساترة واحد لكل بئ…

Representative Results

البروتين NSS من RVFV (عائلة الفيروسات البنياوية، جنس الفاصدة Phlebovirus) 11 يمنع المضيف الخلية النسخ العامة من خلال آليتين متميزتين: (ط) من خلال عزل الوحيدات P44 من عامل النسخ القاعدية TFIIH 11 و (ثانيا) من خلال تشجيع تدهور proteasomal من P62 الوحيدات من TFIIH 6. ?…

Discussion

يصف البروتوكول تنص على طريقة لقياس تأثير عدوى فيروسية في النسخ الخلية المضيفة عن طريق إدماج يوريدين التناظرية الاتحاد الأوروبي في الحمض النووي الريبي الوليدة. هذا الأسلوب له مزايا عديدة أكثر من الطرق السابقة: فهي سريعة وحساسة، وأنها لا تعتمد على استخدام النظائر الم…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر RB تش لتوفير الماوس بولكلونل مكافحة RVFV مصل وM. غريفين من التدفق الخلوي UTMB مرفق الأساسية للحصول على مساعدة مع التدفق الخلوي. وأيد هذا العمل من قبل 5 U54 AI057156 من خلال مركز إقليمي للتميز الغربية، المعاهد الوطنية للصحة منح R01 AI08764301، وبتمويل من مركز سيلي استحداث اللقاحات في UTMB.BK كان مدعوما من قبل صندوق جيمس دبليو ماكلولين زمالة في UTMB.OL كان مدعوما بواسطة R. هيلمان في مرحلة مبكرة جائزة الباحث الوظيفي موريس.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
5-ethynyl-uridine Berry & Associates PY 7563 dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips Fisherbrand 12-545-82  
5 ml polystyrene tubes BD Biosciences 352058  
Actinomycin D (ActD) Sigma 9415 dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen A-11029  
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz sc-2323  
CuSO4 Sigma C-8027 dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI Sigma D-9542 dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM Invitrogen 11965092  
FBS Invitrogen 16000044  
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) Invitrogen A10270  
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) Invitrogen A10277  
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01  
L-ascorbic acid Sigma A-5960 dissolve in H2O for 500 mM
paper filter VWRbrand 28333-087  
paraformaldehyde Sigma 158127  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122  
poly-L-lysine (MW ≥ 70000) Sigma P1274  
Triton X-100 Sigma T-8787  
Trizma base Sigma T-1503 dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056  
Fluorescence Microscope     e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer     e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa

References

  1. Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
  2. Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
  3. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
  4. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  5. Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
  6. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  7. Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
  8. Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
  9. Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
  10. Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
  11. Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. . In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).
  12. Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  13. Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
  14. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  15. Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
  16. Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
  17. Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).

Play Video

Cite This Article
Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Head, J. A., Ikegami, T. Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis. J. Vis. Exp. (78), e50809, doi:10.3791/50809 (2013).

View Video