Summary

Isolamento de tecido adiposo de células imunes

Published: May 22, 2013
doi:

Summary

O tecido adiposo (TA) é um site de ativação imune celular intensa e interação. Quase todas as células do sistema imune estão presentes em AT e as suas proporções são alteradas pela obesidade. Isolamento adequado, quantificação e caracterização de populações de células imunes são fundamentais para a compreensão do seu papel na doença immunometabolic.

Abstract

A descoberta de aumento de infiltração de macrófagos no tecido adiposo (TA) de roedores obesos e humanos conduziu a um interesse em intensificação da contribuição de células imunes à resistência à insulina local e sistémica. O isolamento e quantificação de populações de células imunitárias diferentes nos magros e obesos AT é agora uma técnica vulgarmente utilizada em laboratórios immunometabolism; Ainda extremo cuidado deve ser feita tanto no isolamento das células vasculares do estroma e na análise de citometria de fluxo, de modo que os dados obtidos são fiáveis ​​e podem ser interpretados . Neste vídeo demonstramos como picar, digerir, e isolar a fração de células enriquecido estroma vascular imunológico. Posteriormente, vamos mostrar como anticorpos rótulo macrófagos e linfócitos T e como fazer corretamente portão los em experimentos de citometria de fluxo. Representante de citometria de fluxo de parcelas provenientes de gordura alimentados com ratos obesos alimentados com gordura de baixa magra e alta são fornecidos. Um elemento crítico da presente análise é o uso de anticorpos que fazemnão fluorescência nos canais onde a AT macrófagos são naturalmente autofluorescent, bem como o uso de controles de compensação adequados.

Introduction

Historicamente, o tecido adiposo (TA) tem sido visto como um órgão inerte de armazenamento de lípidos, a qual expande e contrai em resposta ao equilíbrio de energia. Agora entendemos que a AT representa um órgão endócrino dinâmico que secreta ativamente uma série de hormônios que influenciam diretamente no comportamento alimentar e homeostase da glicose sistêmica. Além disso, durante a última década tem havido uma apreciação crescente para as numerosas populações de células do sistema imunológico que residem na fracção vascular do estroma EM (SVF), bem como a sua contribuição para a AT homeostase.

A capacidade para separar o EM adipócito e SVF utilizando uma digest de colagenase seguido de centrifugação diferencial foi descrita pela primeira vez em 1964 por Rodbell 1. Colagenase II é mais frequentemente usado para a separação dos adipócitos e SVF devido à manutenção de receptores de insulina adipócitos 1. Logo no início, fracionamento enzimática da AT foi utilizada principalmente para estudar Adipocyte metabolismo e para isolar pré-adipócitos. Mais recentemente, essa técnica, combinada com a ampla disponibilidade de cytometers fluxo eo número cada vez maior de anticorpos a fluoróforos, disponíveis comercialmente, tem facilitado a caracterização da AT células do sistema imunológico.

Embora a presença de células imunes em inflamada no tinha sido descrita anteriormente 2, os papéis seminais de Weisberg et al. e Xu et al. publicado em 2003, foram os primeiros a documentar o acúmulo de AT macrófagos (ATMs) em obesidade, que secretam citocinas inflamatórias e correlacionar com a resistência à insulina AT específica e sistêmica 3,4. Estas observações serviu como a base de um novo campo de investigação recentemente inventado, "immunometabolism" 5, e foram acompanhados por estudos que implicam diferentes populações de células imunitárias, incluindo as células dendríticas, 6 7, mastócitos, células T 8 –10, as células B, células NK 11 12 13, eosinófilos e neutrófilos 14,15 no desenvolvimento da resistência à insulina associada a obesidade.

O objetivo deste artigo é a de proporcionar uma descrição pormenorizada da técnica de digestão de colagenase usada para isolar células da EM SVF e caracterizar ATMs e AT células T através de citometria de fluxo. Este protocolo foi otimizado para mouse AT, no entanto, os telespectadores podem se beneficiar da leitura de um excelente artigo que fornece muitos detalhes sobre a otimização da técnica para o ser humano aos 16 anos. O público-alvo deste artigo inclui investigadores com pouca experiência de trabalho com o mouse AT e realizando citometria de fluxo. Várias considerações práticas para equilibrar o rendimento ea viabilidade celular com o tempo e os recursos são apresentados, bem como os controles de citometria de fluxo ideais para a caracterização de populações de células imunes. Além do nosso protocolo, os leitores são remetidoed com um artigo recente da Jove Basu et al. uma excelente discussão de alguns dos aspectos técnicos da citometria de fluxo para incluir controles e compensações 17 adequadas.

Protocol

1. Reagentes e Suprimentos Antes de se iniciar este protocolo experimental, preparar os seguintes reagentes: 70% de etanol PBS 1X 1X DPBS (sem Ca e Mg), suplementado com 0,5% de BSA FACS buffer: 1X DPBS (sem Ca e Mg), EDTA 2 mM, e 1% de FCS ACK tampão: 150 mM de NH4Cl, 10 mM KHCO 3, e 0,1 mM Na 2 EDTA em água 2. A colheita e preparação do tecido adiposo Eutan?…

Representative Results

A colagenase seguido de digestão de EM por centrifugação diferencial foi usado para isolar o SVF de almofadas de gordura epididimal de ratos C57BL/6J machos alimentados com baixo teor de gordura (10% kcal de gordura) ou rica em gorduras (60% kcal de gordura), dieta (LFD e HFD , respectivamente) durante 16 semanas. Células do SVF foram então marcadas com anticorpos primários fluoróforos para quantificar a percentagem de ATMs viável (Figura 1) e AT células T (Figura 2) através d…

Discussion

O interesse crescente no papel do sistema imunológico nas consequências metabólicas da obesidade levou à utilização generalizada de citometria de fluxo para caracterizar as células imunes do TA. Embora o protocolo exacto irá variar entre laboratórios com base na sua experiência e equipamentos disponíveis, os passos críticos incluem digestão com colagenase, a centrifugação diferencial, e o antigénio da superfície da célula de rotulagem. O objetivo do presente artigo é fornecer um protocolo detalhado e …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JSO é apoiado por um NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH é apoiado por um Heart Association Award americano Investigator Fundada (12EIA8270000). Experimentos de citometria de fluxo foram realizadas no VMC Citometria de Fluxo de Recursos Compartilhados. O VMC Citometria de Fluxo de recursos partilhada é apoiado pelo Digestive Disease Research Center Vanderbilt (DK058404).

Materials

Name Company Catalog #
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml Life Technologies 14190-250
DAPI Life Technologies D3571
BSA Sigma A2153-100G
collagenase Sigma C6885-5G
propidium iodide solution Sigma P4864-10 ml
stable stack 20 microliter Rainin SS-L10
20 microliter filter tips Rainin SRL10F
stable stack 250 microliter tips Rainin SS-L250
1000 microliter tips Rainin GPS-L1000
1000 microliter filter tips Rainin GP-L1000F
250 microliter Filter Tips Rainin SR-L200F
FC Block BD Biosciences 553142
fisher 100mn strainers Fisherbrand 22-363-549
medium weigh dish Fisherbrand 02-202B
aluminum foil Fisherbrand 1213100
mincing scissors Fisherbrand 089531B
Vortex Fisherbrand 2215365
50 ml conical tubes BD Falcon 14-959-49A
filter top FACS tubes BD Falcon 352235
10 ml pipette case 200 BD Falcon 1367520
round bottom tubes BD Falcon 352058
5 ml syringe BD Falcon 309646
V Bottom Plates Costar 07-200-107
transfer bulb pipette Thermo Scientific 13-711-22
Shaker Thermo Scientific 11 676 071
Adhesive mat Thermo Scientific 1368750
Cell Culture Centrifuge Sorvall 75253839
Adapters Sorvall 75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80 eBioscience 17-4801 Fluorophore conjugate: APC
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b eBioscience 11-0112 Fluorophore conjugate: FITC
Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c eBioscience 12-0114 Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2 R&D Systems FAB4297P Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206 R&D Systems FAB2535P Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2 R&D Systems FAB5538P Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ BD Biosciences 553174 Fluorophore conjugate: APC
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a BD Biosciences 552877 Fluorophore conjugate: PE-Cy7
Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4 BD Biosciences 557956 Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 557963

Table 1. List of Materials and Reagents.

References

  1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
  2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
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Cite This Article
Orr, J. S., Kennedy, A. J., Hasty, A. H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis. Exp. (75), e50707, doi:10.3791/50707 (2013).

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