Isolatie van Vetweefsel immuuncellen
Summary
Vetweefsel (AT) is een site van intense immuun cel activatie en interactie. Vrijwel alle cellen van het immuunsysteem aanwezig zijn in AT en hun verhoudingen worden veranderd door obesitas. Goede isolatie, kwantificering en karakterisering van AT immuuncelpopulaties zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van hun rol in immunometabolic ziekte.
Abstract
De ontdekking van verhoogde macrofaag infiltratie in het vetweefsel (AT) zwaarlijvige knaagdieren en mensen heeft geleid tot een intensivering van belang immuuncel bijdrage aan de lokale en systemische insulineresistentie. Isolatie en kwantificering van verschillende immuuncelpopulaties in magere en zwaarlijvige AT is nu een algemeen gebruikte techniek immunometabolism laboratoria Nog uiterste voorzichtigheid geboden zowel in stromale vasculaire cel isolatie en in de flowcytometrie-analyse, zodat de verkregen gegevens betrouwbaar en interpreteerbaar . In deze video laten we zien hoe je gehakt, verteren, en isoleren van de immuun cel-verrijkte stromale vasculaire fractie. Vervolgens laten we zien hoe antilichaam label macrofagen en T-lymfocyten en hoe goed gate op hen in flowcytometrie experimenten. Vertegenwoordiger flowcytometrie percelen van vetarm gevoede mager en vetrijke gevoede zwaarlijvige muizen worden verstrekt. Een essentieel element van deze analyse is het gebruik van antilichamen die welniet fluoresceren in kanalen waar AT macrofagen van nature autofluorescent, alsmede het gebruik van de juiste compensatie controles.
Introduction
Historisch gezien, heeft het vetweefsel (AT) is bekeken als een inerte orgaan van lipide opslag, die uit en krimpt in reactie op de energiebalans. We begrijpen nu dat AT staat voor een dynamische endocrien orgaan dat actief scheidt een aantal hormonen, die rechtstreeks van invloed eetgedrag en systemische glucose-homeostase. Bovendien, de afgelopen tien jaar is er een toenemende appreciatie voor vele populaties van immuuncellen die in de AT stromale vasculaire fractie (SVF), en hun bijdrage aan AT homeostase.
De mogelijkheid om het scheiden AT adipocyten en SVF met een collagenase digestie gevolgd door differentiële centrifugatie werd eerst beschreven door Rodbell in 1964 1. Collagenase II wordt het meest gebruikt voor adipocyten en SVF scheiding vanwege onderhoud van adipocyten insulinereceptoren 1. Vroeg op, enzymatische fractionering van AT werd voornamelijk gebruikt om adipo studerenCyte metabolisme en preadipocytes isoleren. Meer recent is deze techniek, in combinatie met de ruime beschikbaarheid van flowcytometers en de steeds toenemende aantal commercieel beschikbare fluorofoor-geconjugeerde antilichamen, vergemakkelijkt de karakterisering van AT immuuncellen.
Hoewel de aanwezigheid van immuuncellen in ontstoken AT eerder beschreven 2, de rudimentaire papers door Weisberg et al.. en Xu et al.. gepubliceerd in 2003 waren de eerste om de accumulatie van AT macrofagen (ATM) in obesitas, waarbij inflammatoire cytokines uitscheiden en correleren met AT-specifieke en systemische insulineresistentie 3,4 documenteren. Deze waarnemingen diende als basis van een nieuw gebied van onderzoek onlangs bedacht, "immunometabolism," 5 en werden opgevolgd door studies wat impliceert diverse immuuncelpopulaties, waaronder dendritische cellen 6, mestcellen 7, T-cellen 8 –10, B-cellen 11, NKT cellen 12, 13 eosinofielen en neutrofielen 14,15 in de ontwikkeling van obesitas geassocieerd insulineresistentie.
Het doel van dit artikel is een gedetailleerde beschrijving van de collagenase digestie techniek om cellen van het AT SVF isoleren en karakteriseren geldautomaten en AT T cellen via flowcytometrie verschaffen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor muis AT, maar kunnen kijkers genieten van het lezen van een uitstekend artikel verstrekken van uitgebreide informatie over optimalisatie van deze techniek voor menselijke AT 16. De doelgroep van dit artikel bevat de onderzoekers met een beperkte ervaring in het werken met de muis AT en het uitvoeren van flowcytometrie. Een aantal praktische overwegingen voor het balanceren van cellulaire opbrengst en rentabiliteit, tijd en middelen worden verstrekt, alsmede een optimale flowcytometrie controles gepresenteerd voor het karakteriseren van AT immuuncelpopulaties. In aanvulling op ons protocol, lezers zijn referred een recent artikel van Jupiter Basu et al.. een goede bespreking van enkele van de technische aspecten van flowcytometrie passende controles en vergoedingen 17 omvatten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toenemende interesse in de functie van het immuunsysteem in de metabole gevolgen van obesitas heeft geleid tot het wijdverbreide gebruik van flowcytometrie om immune cellen van de AT karakteriseren. Hoewel het exacte protocol zal variëren tussen laboratoria op basis van hun eigen ervaring en beschikbare apparatuur, de kritische stappen omvatten collagenase spijsvertering, differentiële centrifugatie, en celoppervlakantigeen etikettering. Het doel van dit artikel is om een gedetailleerd protocol en praktische gid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JSO wordt ondersteund door een NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), wordt AK ondersteund door een Postdoctoraal Fellowship van de American Diabetes Association (7-10-MI-05), en AHH wordt ondersteund door een American Heart Association Established Investigator Award (12EIA8270000). Flow cytometrie experimenten werden uitgevoerd in de VMC flowcytometrie gedeelde bronnen. De VMC flowcytometrie gedeelde middelen wordt ondersteund door de Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
