Summary

Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

Published: May 22, 2013
doi:

Summary

Le tissu adipeux (AT) est un site d'activation intense des cellules immunitaires et de l'interaction. Presque toutes les cellules du système immunitaire sont présents dans A et leurs rapports sont modifiés par l'obésité. Une bonne isolation, la quantification et la caractérisation des AT populations de cellules immunitaires sont essentielles pour la compréhension de leur rôle dans la maladie immunometabolic.

Abstract

La découverte de l'augmentation de l'infiltration des macrophages dans le tissu adipeux (AT) de rongeurs obèses et les humains a conduit à une intensification de l'intérêt de la contribution des cellules immunitaires à l'insulino-résistance locale et systémique. L'isolement et la quantification des différentes populations de cellules immunitaires dans minces et obèses AT est maintenant une technique couramment utilisée dans les laboratoires de immunometabolism; soins encore extrême doit être pris à la fois dans l'isolement des cellules vasculaires stromales et dans l'analyse de cytométrie en flux de sorte que les données obtenues sont fiables et interprétables . Dans cette vidéo, nous démontrons comment mâche, digérer, et d'isoler la fraction vasculaire enrichie en cellules stromales immunitaire. Par la suite, nous montrons comment les macrophages de l'étiquette d'anticorps et des lymphocytes T et la manière de porte correctement sur eux des expériences de cytométrie en flux. Représentant parcelles de cytométrie de flux de matières grasses nourris gras nourris obèses souris maigres et élevé sont fournis. Un élément essentiel de cette analyse est l'utilisation d'anticorps qui nepas de fluorescence dans les canaux où AT macrophages sont naturellement autofluorescente, ainsi que l'utilisation des contrôles de compensation appropriées.

Introduction

Historiquement, le tissu adipeux (AT) a été considéré comme un organe inerte de stockage des lipides, qui se dilate et se contracte en réaction à l'équilibre énergétique. Nous comprenons maintenant que AT représente un organe endocrine qui sécrète dynamique activement un certain nombre d'hormones, qui influent directement sur le comportement alimentaire et l'homéostasie du glucose systémique. En outre, au cours de la dernière décennie, il ya eu une appréciation croissante pour les nombreuses populations de cellules immunitaires résidant dans l'AT fraction stroma vasculaire (SVF), ainsi que leur contribution à AT homéostasie.

La capacité de séparer le AT adipocyte et SVF en utilisant une collagénase digest suivie par centrifugation différentielle a d'abord été décrit par Rodbell en 1964 1. Collagénase II est le plus souvent utilisé pour la séparation des adipocytes et SVF pour cause de maintenance de récepteurs de l'insuline des adipocytes 1. Dès le début, le fractionnement enzymatique de AT a été principalement utilisé pour étudier adipoCyte métabolisme et d'isoler les pré-adipocytes. Plus récemment, cette technique, combinée avec la large disponibilité des cytomètres et le nombre sans cesse croissant d'anticorps conjugué à un fluorophore disponibles dans le commerce, a facilité la caractérisation des cellules immunitaires AT.

Bien que la présence de cellules immunitaires dans enflammée AT avait été décrit précédemment 2, les articles fondateurs de Weisberg et al. et Xu et al. publié en 2003 furent les premiers à documenter l'accumulation de macrophages AT (GAB) dans l'obésité, qui sécrètent des cytokines inflammatoires et en corrélation avec la résistance à l'insuline AT-spécifique et systémique 3,4. Ces observations ont servi de base d'un nouveau champ d'investigation récemment inventé, "immunometabolism," 5 et ont été suivies par des études impliquant différentes populations de cellules immunitaires, dont les cellules dendritiques, les mastocytes 6 7, 8 cellules T 10, les cellules B, les cellules NKT 11 12 13, les éosinophiles, les neutrophiles et 14,15 dans le développement de l'obésité associée à une résistance à l'insuline.

Le but de cet article est de fournir une description détaillée de la technique digest collagénase utilisée pour isoler les cellules de la SVF AT et de caractériser les guichets automatiques et AT cellules T via la cytométrie de flux. Ce protocole a été optimisé pour les souris AT; toutefois, les téléspectateurs peuvent bénéficier de la lecture d'un excellent article fournissant de nombreux détails sur l'optimisation de cette technique pour l'homme à 16 ans. Le public cible de cet article comprend des enquêteurs ayant une expérience limitée de travail avec la souris à effectuer et cytométrie de flux. Plusieurs considérations pratiques pour équilibrer le rendement et la viabilité cellulaire avec le temps et les ressources sont présentées ainsi que des contrôles de cytométrie de flux optimales pour caractériser les populations de cellules immunitaires. En plus de notre protocole, les lecteurs sont referred à un article de JoVE récente par Basu et al. pour une excellente discussion de quelques-uns des aspects techniques de cytométrie en flux pour inclure des contrôles et des compensations adéquates 17.

Protocol

1. Réactifs et Consommables Avant de lancer ce protocole expérimental, préparer les réactifs suivants: Éthanol à 70% PBS 1X 1X DPBS (sans Ca et Mg) supplémenté avec 0,5% de BSA FACS tampon: 1X DPBS (sans Ca et Mg), EDTA 2 mM, et 1% de SVF Tampon ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 et 0,1 mM Na 2 EDTA dans l'eau 2. La récolte et la préparation du tissu adipeux <…

Representative Results

Collagénase digestion d'AT suivie par centrifugation différentielle a été utilisée pour isoler le SVF de coussinets adipeux épididymaires de souris C57BL/6J mâles nourris avec une faible teneur en gras (10% kcal provenant du gras) ou riche en graisses (60% kcal provenant du gras) régime (LFD et HFD , respectivement) pendant 16 semaines. Les cellules de la FSV ont ensuite été marquées avec des anticorps primaires fluorophore conjugué à quantifier la proportion de guichets automatiques viable (fig…

Discussion

L'intérêt croissant pour le rôle du système immunitaire dans les conséquences métaboliques de l'obésité a conduit à l'utilisation généralisée de la cytométrie en flux pour caractériser les cellules immunitaires de l'AT. Bien que le protocole exact variera entre laboratoires basés sur leur propre expérience et de l'équipement disponible, les étapes essentielles comprennent digestion à la collagénase, centrifugation différentielle, et la surface des cellules antigène étiquetage. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JSO est soutenu par une NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de l'American Diabetes Association (7-10-MI-05), et AHH est soutenu par une bourse de chercheur de l'American Heart Association Établi (12EIA8270000). expériences de cytométrie de flux ont été réalisées dans le MVC cytométrie en flux ressource partagée. Le MVC cytométrie en flux ressource partagée est soutenue par la Digestive Disease Research Center Vanderbilt (DK058404).

Materials

Name Company Catalog #
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml Life Technologies 14190-250
DAPI Life Technologies D3571
BSA Sigma A2153-100G
collagenase Sigma C6885-5G
propidium iodide solution Sigma P4864-10 ml
stable stack 20 microliter Rainin SS-L10
20 microliter filter tips Rainin SRL10F
stable stack 250 microliter tips Rainin SS-L250
1000 microliter tips Rainin GPS-L1000
1000 microliter filter tips Rainin GP-L1000F
250 microliter Filter Tips Rainin SR-L200F
FC Block BD Biosciences 553142
fisher 100mn strainers Fisherbrand 22-363-549
medium weigh dish Fisherbrand 02-202B
aluminum foil Fisherbrand 1213100
mincing scissors Fisherbrand 089531B
Vortex Fisherbrand 2215365
50 ml conical tubes BD Falcon 14-959-49A
filter top FACS tubes BD Falcon 352235
10 ml pipette case 200 BD Falcon 1367520
round bottom tubes BD Falcon 352058
5 ml syringe BD Falcon 309646
V Bottom Plates Costar 07-200-107
transfer bulb pipette Thermo Scientific 13-711-22
Shaker Thermo Scientific 11 676 071
Adhesive mat Thermo Scientific 1368750
Cell Culture Centrifuge Sorvall 75253839
Adapters Sorvall 75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80 eBioscience 17-4801 Fluorophore conjugate: APC
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b eBioscience 11-0112 Fluorophore conjugate: FITC
Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c eBioscience 12-0114 Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2 R&D Systems FAB4297P Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206 R&D Systems FAB2535P Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2 R&D Systems FAB5538P Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ BD Biosciences 553174 Fluorophore conjugate: APC
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a BD Biosciences 552877 Fluorophore conjugate: PE-Cy7
Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4 BD Biosciences 557956 Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 557963

Table 1. List of Materials and Reagents.

References

  1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
  2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
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Cite This Article
Orr, J. S., Kennedy, A. J., Hasty, A. H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis. Exp. (75), e50707, doi:10.3791/50707 (2013).

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