Temassız dielektroforez (cDEP) kendi içsel dielektrik özellikleri aracılığıyla sıralama ve parçacıkların zenginleştirme ulaşır. Fluidic elektrot kanallar steril karakterizasyonu olmayan zarar ve biyolojik parçacıkların sıralamaya cDEP takım elbise kumaşı, DEP geleneksel metalik elektrotlar değiştirin. Biz bir cDEP mikrocihazda hazırlamak ve hücre karakterizasyonu ve sıralama deneyler nasıl gösterilmektedir.
Dielektroforez, (DEP) bir tek biçimli olmayan elektrik alanı partiküller translasyonel hareket geçmesi polarize hangi bir olgudur ve bir yüzey işaretleyici bağımsız bir şekilde mikro-hareket yönlendirmek için kullanılabilir. Geleneksel olarak, DEP cihazlar örnek kanal model verilmiş düzlemsel metalik elektrotlar içerir. Bu yaklaşım, pahalı olması ve özel bir temiz oda ortamı gerektirir. Son zamanlarda, temassız dielektroforez (cDEP) denilen bir temas içermeyen bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntem, doğrudan desenleme akışkan elektrotlar tarafından elektrotları ve numune arasındaki teması ve tek polidimetilsiloksanın (PDMS) alt tabaka bir örnek kanal kaçınarak DEP klasik ilkesini kullanır ve mikropartiküller sıralamak ve zenginleştirmek için tasarlanan hızlı microfluidic stratejisi olarak uygulaması vardır. Bu yönteme özgü elektrik alanı ayrılır son derece iletken sıvı, ihtiva eden akışkan elektrot kanalları ile oluşturulur olmasıdırince bir yalıtkan bariyer tarafından örnek kanal. Metal elektrotlar doğrudan numune ile temas olmadığından, elektroliz, elektrot delaminasyon ve örnek kontaminasyon önlenir. Ayrıca, bu, ucuz ve basit bir imalat işlemi sağlar.
cDEP böylece hassas biyolojik parçacıkların manipüle edilmesi için çok uygundur. Parçacıkların üzerine etki eden dielektroforetik kuvvet cihaz geometri özelleştirilebilir tasarımı tarafından üretilen elektrik alanı uzamsal gradyan, ancak hücrenin iç biyofiziksel özellikleri üzerinde sadece bağlıdır. Bu nedenle, hala cDEP bioparticles karakterizasyonu, zenginleştirme ve sıralama izin verirken değişken, bir popülasyon içinde eksprese edilebilir bir yüzey olarak ifade edilen moleküler biyolojik bağlı olarak önler bir etiket içermeyen bir tekniktir.
Burada, biz cDEP kullanarak imalat ve deney temellerini göstermektedir. Bu yumuşak litografi kullanarak bir cDEP çipin basit hazırlanmasını açıklary teknikleri. Bir parçacık ya da hücre, dielektroforetik kuvvet sıfır olduğu frekansın geçiş frekansını karakterize etmek için deneysel prosedür tartışır. Son olarak, yumurtalık kanseri hücrelerinin bir karışımını ayırma ve mikro küreler (boncuk) flüoresan için bu tekniğin kullanımını göstermektedir.
Biyolojik örnek zenginleştirme ve parçacık ayırma sonraki analiz için çoğu zaman gereklidir. 1. Örneğin, vücut sıvılarından nadir hücrelerinin izolasyonu kanser tespiti ve tek tek tıp kapsamında önemli tatbikatlara sahiptir. 2,3 En yaygın olarak kullanılan ayırma teknikleri zenginleştirme floresan aktive hücre vardır (FACS ) 4 ve manyetik aktif hücre (MACS), hücreleri ayırt etmek için ifade yüzey belirteçleri güvenmek 5 sıralama. Diğer stratejiler hidrodinamik 6 ya da atalet 7,8 sıralama, optik cımbız, acoustophoresis 9, 10, ve dielektroforez bulunmaktadır. 11,12 Dielektroforez, düzgün olmayan bir elektrik alanı varlığında, bir polarize parçacığın hareketidir. 13 DEP için kullanılmıştır geniş bir uygulama yelpazesi, 2,14 canlılığı, 15 hücrelerin biyoelektrik özelliklerini karakterize dayalı sıralama hücreleri de dahil olmak üzere, 16 ve sıralamahücre biyofiziksel özellikleri bağlı değişiklikleri üzerine ing. 17,18 geleneksel DEP bir voltaj uygulamak ve bu güçlü bir tekniktir da düzgün olmayan bir elektrik alanı. 13 uyarılması için bir mikroakışkan kanal içinde desenli düzlemsel elektrotlar kullanan, zorluklar gibi ortaya çıkabilir elektrot katmanlarına ayrılma ve elektroliz. İzolatör bazlı dielektroforez (IDEP) 19 tıkanmayı elektrot delaminasyonu ve bir DC elektrik alanı gayri muntazamlıkların neden model verme izolasyon yapıları ile elektrot alanının mekansal bozulması zorluklarını ele almıştır. IDEP seçici olarak canlı ve ölü bakteri hücrelerinin ayrılması için kullanılmış, 19 bakteriyel sporlar, 20 ve işlemek DNA, diğer uygulamalar arasında 21 izole eder. Genellikle gerekli yüksek DC gerilimlerin bir sonucu olarak oluşabilir çünkü Joule ısıtma bir meydan okuma olabilir. Bu zorlukları düzeltmek için, temassız DEP mikrovasıtalar geliştirilmiştir. 22-24
<p class = "jove_content"> Burada sunulan teknik o kadar metalik elektrotlar ve örnek kanal arasında doğrudan temas olmaması için adlandırılmış, temassız dielektroforez (cDEP) kullanır., bu stratejiye Benzersiz 22 ile dolu sıvı elektrot kanalları ile metalik elektrotlar yedek Bir son derece iletken bir çözüm. Bu sıvı elektrotlar, kapasitif bir AC gerilim ile örnek kanala ince bir yalıtım engeli boyunca birleştirilir. Elektrotlar ile örnek temasını ortadan kaldırmak gibi elektroliz ve kabarcık oluşumu, numune kontaminasyonu ve elektrot delaminasyonu gibi DEP-tabanlı yöntemler ile ilgili sorunları azaltır. Bu örnekteki hücrelerin canlılığını destekler çünkü, bir sonuç olarak, cDEP biyolojik örnekler için özellikle yararlıdır. Önemlisi, cDEP örnek sterilite koruyabilirsiniz. Bir çip, bir hücre kültürü kaputu hazırlanabilir ve deney metal elektrotlara örnek temas gerektiren veya örnek environme açık olmasını gerektirmeden yapılabilirnt. Basit bir rezervuar steril numune kurtarma kolaylaştırmak için çip çıkışına monte edilebilir. Buna ek olarak, örnek kanal ile aynı biyolojik olarak uyumlu polimer malzemenin (PDMS) sıvı elektrot üretim metal elektrotların özel modelleme, üretim için gerekli olan zaman ile ortaya çıkan yüksek maliyetini düşürür, ve ilk modelleme için özel temiz oda için ihtiyacı sınırlar yeniden silikon gofret damga.DEP nedeniyle parçacıkların hareketi, tanecik ve ortamın yanı sıra, elektrik alanının uzaysal gradyanlar özelliklerine bağlıdır. Bir parçacık ve frekans-bağımlı faktör, Clausius-Mossotti (CM) faktörü olarak adlandırılan, aralık -0.5 1 bir değer alır ve DEP kuvvet yönünü belirler. CM faktör tam sıfır olduğu frekans geçiş frekansı denir. Bu hiçbir dielektroforetik kuvvet bir parçacığın ve CM faktör değişiklikleri işaretine uygulanan edildiği noktadır. A sinert katı mikrosferlerin ingle geçiş frekansı oluşur negatif pozitif CM faktör değişiklikleri 0.01 S / m, NDEP gelen pDEP 10'a yakın var bir geçiş gösteren bir birinci geçit sıklık sırasına düşük iletkenlik tampon memeli hücreleri için 25. – 100 kHz ve boyut, şekil, hücre iskeleti ve hücrenin membran özellikleri tarafından etkilenmiştir. 26,27 NDEP rejimine pDEP bir vardiyada ikinci bir eşik frekansı 10 MHz mertebesindedir, ve etkilenir çekirdek-sitoplazma oranı, sitoplazma iletkenlik ve endoplazmik retikulum. 27 DEP kuvvet sıvı akışının varlığı olmadan uygulanabilir, ancak burada süspansiyon halindeki partiküllerin sürekli bir sıralama elde etmek için bir akan sıvı kullanmaktadır. Dielelektroforetik kuvvet ve Stokes sürtünme kuvveti kombine etkisi, bir parçacığın öteleme hareketini belirleyecektir.
İki frekans aralıklarında işlem için cihazlar geliştirilmiştir. Yükseköğretim frequency cihazları (100-600 kHz) gibi prostat tümörü başlatan hücrelerin (TIC), kemirgen over yüzey epitel (MOSE) hücreleri, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücre olarak, pDEP ve hücrelerin elde toplu sıralama ile çalıştırılabilir, ya da THP canlı adres seçici örnek kanalında bulunan Mesajları yalıtım ilgi hücreleri yakalayarak -1 hücreler. 28-31 daha düşük frekans (5-100 kHz) cihazlar sürekli işletmek ve bir frekansta çalıştırıldığında bir nüfus plan nüfus deneyimleri sırasında pDEP deneyimleri hangi NDEP, sıralama elde etmek için parçacık yörüngeleri yönlendirebilirsiniz. 32-34 Bu düşük frekanslı cihazlar, kırmızı kan hücrelerinin kanser hücrelerini sıralamak ilerici MOSE hücre hattının dielektrik özelliklerindeki değişimleri belirlemek ve olmayan etkilerini aydınlatmak için kullanılmıştır agresif MOSE hücrelerin saldırgan özelliklerini tersine üzerinde toksik sphingolipid tedaviler. Buna ek olarak, şu an cDEP mikrovasıtalar kadar 1 ml / saat, artan bir çıktı ile çalışmak üzere dizayn edilebilirr. 31,35
Tarif edildiği gibi, esneklik ve üretim sürecinin düşük maliyetli sunulan deney prosedürü, geniş bir uygulama aralığı için uygun olması için izin özel olarak tasarlanmış cihaz geometrileri, sağlar. CDEP uzun vadeli hedefi müteakip kültür ya da işleme için örnek kurtarma ile, bir klinik düzeyde etiket-free cep sıralama ve zenginleştirme gerçekleştirmektir. Burada sunulan teknik DEP erişilebilirliğini artırır, imalattan gelen deney için, basit ve ucuz bir yöntemdir. Biz, karakterizasyonu ve floresan mikro yumurtalık kanser hücrelerinin çoğalmasını, elde etmek için bir çip cDEP hazırlanmasını ve deney protokolü göstermektedir.
DEP parçacıkların dielektrik özelliklerinin belirlenmesi ve izolasyon veya zenginleştirme uygulamaları sıralama doğru parçacık hareketini yönlendirmek için güçlü bir tekniktir. Nedeniyle bir numune ile doğrudan temas elektrod zararlı etkisi, başkalarının temasını önlemek için, daha önce sunulan yönteme benzer yaklaşımlar geliştirmişlerdir. Örneğin, Beşir vd. Ince bir cam lamel ile baskılı devre kartı elektrotlar ayrılmış microfluidic PDMS cihaz kullanarak temassız DEP cihazları geliştirildi ve bu teknik aynı zamanda video formatında kullanılabilir yapılır. 23,36
Burada, tek bir PDMS substrat kullanılarak bir çip cDEP ve akışkan elektrotların imalat ve hücre ve floresan boncuk karışımından yumurtalık kanser hücrelerinin ayrılması için deney protokolü göstermiştir. Sunulan tekniği başarıyla liv sıralama içeren daha karmaşık ve fizyolojik ilgili uygulamalar, çeşitli için kullanılır olmuşture ve ölü hücreler, 28 tümör prostat kanseri hücreleri hücreler söz seyreltilmiş, kırmızı kan hücreleri, 31,32 ve 37 meme kanseri ve yumurtalık kanseri aşamalar arasında farklılaşan 30 kanser hücreleri. 29 cDEP da parçacıkların karıştırılması için kullanılmıştır. 38 Bu uygulamalar yer alan basit bir teknik kullanılarak, çeşitli amaçlar kanal geometrisinin tasarımını değiştirerek basitçe gerçekleştirilebilir olduğunu göstermektedir.
. DEP parçacıklar küresel parçacıklar için 13 manipülasyonu için böylece mikro yararlı olan, translasyon dielektroforetik kuvvet büyüklüğü ve elektrik parçacık ve süspansiyon ortamının özellikleri, hem de elektrik alanının gradyanı kare bağlıdır:
ε m süspansiyon ortamının geçirgenliği olduğu, r yarıçapıParçacığın ve Rc [k (ω)] Clausius-Mossotti (CM) faktörü gerçek bir parçasıdır. CM etken süspansiyon ortamı ile karşılaştırıldığında parçacık göreli polarize bir ölçüsüdür ve dielektroforetik kuvvet yönünü belirler. Bu olarak tanımlanmaktadır
nerede ve sırasıyla parçacık ve orta, karmaşık geçirgenlik değerinin bulunmaktadır. Karmaşık geçirgenlik, , Iletkenlik (σ) ve frekans (ω) bağlıdır. Küresel parçacıklar CM faktörü teorik olarak -0.5 ve 1 arasında bağlıdır. CM faktör negatif ise orta parçacık daha polarize olabilir, yani parçacıklar bölgelerinden uzaklaşacak, çünkü, parçacıklar NDEP deneyimyüksek elektrik alan eğimleri. CM faktörü pozitif ise, parçacıklar orta daha fazla polarize olabilir ve bunlar, yüksek elektrik alan gradyanları bölgelerine doğru hareket ettiği pDEP deneyim.
Bu hücrelerin gibi yapıda homojen olmayan biyolojik parçacıklar için, Clausius-Mossotti faktör parçacık geçirgenlik için etkili değerinden belirlenebilir:
nerede ve örneğin, sırasıyla sitoplazma gibi hücresinin iç, ve plazma membranı, etkin kompleks geçirgenlik ve karmaşık geçirgenliği olan,. r hücrenin yarıçapı, d, plazma zarının kalınlığı 26
Özellikle de, bir süspansiyon içinde parçacıklarla oluştuğundaSıvı, akışkan verilmesi için parçacık nisbetle hareket parçacık üzerinde bir sürükleme kuvveti oluşturur. Parçacık üzerindeki genel kuvvetini belirleyen bu sürtünme kuvveti dikkate alınmalıdır. Burada ilgi durumlar için, viskoz kuvvetlerin hakim ve parçacıklar, küresel, küçük ve nispeten düşük hız ile hareket kabul edilir, bu yüzden Stokes 'sürükle yasa sürtünme kuvveti için iyi bir yaklaşım sağlamaktadır:
η akışkanın viskozitesidir burada, u p parçacığın hızıdır, ve f u da hareketli olabilir sıvısının hızıdır. Dielektroforetik kuvvet, sıvı ve partikül özellikleri bilinmektedir ve bilinen bir akış hızı göz önüne alındığında, sürtünme kuvveti ve dielektroforetik kuvvet arasındaki denge parçacık hızını tahmin etmek için çözülebilir. Hücreler deneyim eşiğin altında olması gerekmektedir kesme oranı olan, c, enell yokedici oluşabilir.
Parçacıkların elektriksel özelliklerinin karakterizasyonu tahmin ve DEP altında nasıl tepki vereceğini kontrol etmek gereklidir. Bu çalışmada, özellikle hücrelerin ilk geçiş frekansını belirlemek için protokol göstermek için MOSE-L hücreleri ile düşük frekanslı cDEP kullanılan ve daha sonra muhalif DEP cevaplara dayanarak polistiren boncuklar ve MOSE-L hücrelerinin sürekli sıralama gösterdi.
CDEP cihazın geometrik cihazlar yüksek frekans veya düşük frekanslı bir biçimde çalıştırılabilmesi için tasarlanmış izin vererek, elektrik alanının uzamsal değişim derecelerine değiştirebilir ve yüksek seçicilik ve belirli bir hücre tipi için ayırma verimliliği için değiştirme olur. Ayrıca, yüksek kapasiteli cihazlar daha geniş bir kanal imal edilmesi ile geliştirilebilir, paralel, 30 olarak ya da dikey olarak elektrot kanalları nispeten derin altında ve üstünde istiflenmiş olan çok katmanlı imalat 35, 30 kanallarörnek kanalı. Ince zarlar tabakalar arasındaki bir bariyer oluşturur. Polimetilmetakrilat (PMMA) ve polikarbonat fabrikasyon cihazlar ile ön test (PC) ince filmler MOSE-L hücrelerinin DEP tepki göstermiştir. Şimdiki çabalar, çok katmanlı yüksek verimli cihazlar rafine ve nihai bir plug-and-play platform karşı periferik sistemini geliştirmek için çalışmalar devam etmektedir. Sunulan temel deneysel tekniği genişletmek için, cihazın uygulamalar ve özellikler gibi karakterizasyonu karşı sıralama veya cihaza örnek rezervuarları ve yarı-otomatik sistem ekleme gibi özel talepleri sığdırmak için uygun olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Desteklenen bu çalışma, Ulusal Bilim Hibe No EFRI 0938047 altında Vakfı ve Kritik Teknoloji ve Uygulamalı Bilimler Virginia Tech Enstitüsü (İÇTAŞ) tarafından kısmen desteklenmiştir. Yazarlar MOSE-L hücrelerinin kendi tür hediye Dr Eva Schmelz ve Dr Paul Roberts için takdirlerimi ifade etmek isterim. Yazarlar onun bu belgeyi düzenleme ve deney hazırlama ile ona yardım için hücre kültürü, caitlan Swaffar ile yardım ve tüm Bioelectromechanical Sistemleri laboratuvar üyeleri için Angela Anderson kabul.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI,USA | Sylgard 184 | |
Glass slides | The Microscope Depot | 76079 | 2×3 inch-ground edges |
Microbore PTFE Tubing | Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA | EW-06417-31 | Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll |
Luer-slip plastic syringes | National Scientific company | S7510-1 | |
Needle tip | Howard Electronic instruments | JG20-1.0 | 20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″ |
D(+)-Sucrose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S3-500 | |
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous | Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ | AC410955000 | |
RPMI-1640 Medium | Quality Biological Inc. | 112-025-101 | |
Calcein AM, Molecular Probes | Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA | C3100MP | excitation wavelength 488/emission wavelength 516 |
Rhodamine B, O | Science Lab | SLR1465-100G | excitation wavelength 540/emission wavelength 625 |
Phosphate buffered saline (10X) | Gbiosciences, St. Louis, MO | RC-147 | |
Leica, inverted light microscope | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DMI 6000B | |
Leica DFC420, color camera | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DFC420 | |
Function generator | GW Instek, Taipei, Taiwan | GFG-3015 | |
Wideband power amplifier | Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA | AL-50HF-A | |
HFHV Output Transformer | AL-T50-V25/300-F100K-600K | ||
High voltage amplifier | Trek | Model 2205 | |
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz | AgilentTechnologies | U2701A | |
Expanded Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001/002 (115/230V) | air plasma |
Scotch Magic tape | 3M | any available width is sufficient | |
1.5 mm puncher | Harris Uni-Core | Z708836-25EA | |
.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
FluoSpheres Sulfate Microspheres | Invitrogen | F8858 | 4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605) |
AZ 9260 photoresist | AZ Electronic Materials | ||
AZ 400 K developer | AZ Electronic Materials | ||
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25% | provided by Virginia Tech cleanroom | ||
Teflon coating | applied using DRIE machine | ||
Silicon wafer | University Wafer | 452 | 100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP) |
Deep Reactive Ion Etching (DRIE) | Alcatrel | AMS SDE 100 |