Kontaktlose Dielektrophorese (cDEP) erreicht Sortierung und Anreicherung der Partikel über ihren inneren dielektrischen Eigenschaften. Fluidic Elektrodenkanäle ersetzen traditionelle metallische Elektroden, um DEP, passend cDEP auf nicht-sterile beschädigen Charakterisierung und Sortierung von biologischen Partikeln. Wir zeigen, wie man eine cDEP Kleinst vorzubereiten und durchzuführen Zellcharakterisierung und Sortierversuche.
Dielektrophorese (DEP) ist das Phänomen, durch das polarisierte Teilchen in einer nicht-gleichförmigen elektrischen Feldes Translationsbewegung unterzogen, und kann verwendet werden, um die Bewegung der Mikropartikel in einer Oberflächenmarker-unabhängigen Weise zu lenken. Traditionell DEP Geräten gehören planaren Metallelektroden im Probenkanal gemustert. Dieser Ansatz kann teuer werden und erfordert eine spezielle Reinraumumgebung. Kürzlich wurde eine berührungsfreie Ansatz namens kontakt Dielektrophorese (cDEP) entwickelt worden. Dieses Verfahren nutzt die klassischen Prinzip der DEP, dabei direkten Kontakt zwischen Elektroden und Probe durch Strukturierung fluidischen Elektroden und ein Probenkanal aus einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrat und findet Anwendung als schneller Mikrofluidik-Strategie, zu sortieren und zu bereichern Mikropartikeln. Einzigartig an dieser Methode ist, dass das elektrische Feld über fluidische Elektrodenkanäle hat, die eine leitfähige Flüssigkeit, die von der getrennt erzeugtProbenkanal durch eine dünne isolierende Barriere. Da Metallelektroden nicht direkt an die Probe, Elektrolyse, Elektrode Delamination und Kontamination der Probe vermieden werden. Zusätzlich ermöglicht dies eine preiswerte und einfache Herstellungsverfahren.
cDEP ist somit zur Manipulation sensitive biologische Partikel geeignet. Die auf die Partikel wirkenden Dielektrophoresekraft hängt nicht nur von räumlichen Gradienten des elektrischen Feldes durch anpassbare Design des Gerätes Geometrie erzeugt, aber die inneren biophysikalischen Eigenschaften der Zelle. Als solches ist cDEP eine markierungsfreie Technik, die je nach Oberflächen ausgedrückt molekularen Biomarkern, die variabel innerhalb einer Population ausgedrückt werden kann, während weiterhin Charakterisierung, Anreicherung, und Sortierung von Biopartikel vermeidet.
Hier zeigen wir die Grundlagen der Herstellung und Experimentieren mit cDEP. Wir erklären die einfache Zubereitung eines cDEP Chip mit weichen Lithographiey-Techniken. Wir diskutieren die experimentelle Verfahren zur Charakterisierung Gangsfrequenz eines Teilchens oder einer Zelle, die Frequenz, bei der die dielektrophoretische Kraft Null. Schließlich zeigen wir die Verwendung dieser Technik zum Sortieren einer Mischung von Eierstockkrebszellen und fluoreszierenden Mikrokugeln (Perlen).
Biologische Probenanreicherung und Partikelsortierung ist oft notwendig für die nachfolgende Analyse. 1 beispielsweise Isolierung seltener Zellen aus Körperflüssigkeiten, hat wichtige Anwendungen in der Krebs-Erkennung und eine personalisierte Medizin. 2,3 Die am häufigsten verwendeten Anreicherungstechniken sind Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS ) 4 und der magnetischen Zellsortierung (MACS), 5, die auf Oberflächenmarker exprimiert verlassen, um Zellen zu differenzieren. Andere Strategien umfassen die hydrodynamischen Trägheits 6 oder 7,8 Sortierung, optische Pinzetten, acoustophoresis 9, 10 und Dielektrophorese. 11,12 Dielektrophorese ist die Bewegung eines polarisierten Teilchen in der Gegenwart eines nicht-gleichförmigen elektrischen Feldes. 13 DEP für benutzt eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich Sortierung 2,14 Zellen auf Lebensfähigkeit, 15 Charakterisierung bioelektrischen Eigenschaften von Zellen, 16 und Artten beim induzierten Veränderungen in den biophysikalischen Eigenschaften der Zellen. 17,18 Traditionelle DEP verwendet planaren Elektroden in einem mikrofluidischen Kanal, um eine Spannung zu induzieren, und ein nicht-gleichförmiges elektrisches Feld. 13. Zwar ist dies eine wirkungsvolle Technik strukturiert wird, können Probleme auftreten, wie z. B. Elektrode Delaminierung und Elektrolyse. Isolatorbasis Dielektrophorese (iDEP) 19 hat die Herausforderungen des Fouling Elektrode Delaminierung und räumliche Verschlechterung der Feldelektrode durch Strukturieren isolierende Strukturen, die Ungleichmäßigkeiten in einem elektrischen Gleichstromfeld induziert gerichtet. iDEP verwendet worden ist, um selektiv zu trennen lebenden und toten Bakterienzellen, Bakteriensporen 19 zu isolieren, 20 und manipulieren DNA, 21 unter anderen Anwendungen. Joulesche Erwärmung kann eine Herausforderung sein, da es infolge der hohen Gleichspannungen auftreten, oft erforderlich. Um diese Herausforderungen zu verbessern, haben die berührungslose DEP Mikrobauelementen entwickelt. 22-24
<p class = "jove_content"> Die hier vorgestellte Technik nutzt kontakt Dielektrophorese (cDEP), das Fehlen eines direkten Kontakts zwischen den Metallelektroden und den Probenkanal so benannt. 22 Einzigartig an dieser Strategie ist der Ersatz von metallischen Elektroden mit Flüssigkeit gefüllten Elektrodenkanäle mit eine hoch leitfähige Lösung. Diese Fluid Elektroden kapazitiv über eine dünne isolierende Barriere zur Probe Kanal über eine Wechselspannung gekoppelt. Die Beseitigung Probe Kontakt mit den Elektroden reduziert Probleme mit DEP-basierte Methoden wie Elektrolyse und Blasenbildung, Probenkontamination und Delamination Elektrode verbunden. Als Ergebnis ist cDEP besonders nützlich für biologische Proben, da es unterstützt die Lebensfähigkeit der Zellen in der Probe. Wichtig ist, dass cDEP Probe Sterilität zu erhalten. Ein Chip kann in einer Zellkultur Haube vorbereitet werden und das Experiment kann ohne Probenkontakt zu Metallelektroden oder zu verlangen, dass die Probe offen für die environme sein durchgeführt werdennt. Eine einfache Reservoir kann auf den Chip Steckdose befestigt werden, um sterile Probenrückgewinnung erleichtern. Zusätzlich ist die Herstellung von Fluid Elektroden aus demselben biokompatiblen Polymermaterial (PDMS) als Probenkanal reduziert die hohe Kosten mit benutzerdefinierten Strukturierung von Metallelektroden, die für die Herstellung erforderliche Zeit entstehen, und begrenzt die Notwendigkeit für spezielle Reinraumanlagen für die Anfangsmuster der wiederverwendbaren Silizium-Wafer-Briefmarke.Bewegung der Teilchen aufgrund DEP hängt von den Eigenschaften des Teilchens und des Mediums, als auch die räumlichen Gradienten des elektrischen Feldes. Ein Partikel-und frequenzabhängigen Faktor, genannt der Clausius-Mossotti (CM)-Faktor, nimmt einen Wert im Bereich von -0,5 bis 1 und bestimmt die Richtung der DEP-Kraft. Die Frequenz, bei der das CM Faktor gleich Null ist, die Übergangsfrequenz bezeichnet. Dies ist der Punkt, an dem kein dielektrophoretische Kraft auf ein Partikel und dem CM Faktoränderungen Vorzeichen ausgeübt wird. A single Gangsfrequenz für inerte feste Mikrokügelchen tritt auf, wenn die CM-Faktor ändert sich von negativ auf positiv 25 Für Säugerzellen in geringer Leitfähigkeit Puffer in der Größenordnung von 0,01 S / m, einer ersten Übergangsfrequenz, die einen Übergang von nDEP zu pDEP nahe 10 existiert. – 100 kHz, und wird durch die Größe, Form, Zytoskelett und Membraneigenschaften der Zelle beeinflusst. 26,27 Eine zweite Übergangsfrequenz bei einer Verschiebung von der pDEP zu nDEP Regime ist in der Größenordnung von 10 MHz und wird durch das beeinflusst Kern-Zytoplasma-Verhältnis, Zytoplasma Leitfähigkeit und endoplasmatischen Retikulum. 27 DEP-Kraft kann ohne die Anwesenheit der Fluidströmung verwendet werden, aber hier verwenden wir ein fließendes Fluid kontinuierlich Sortierung der suspendierten Partikel zu erzielen. Der kombinierte Einfluss der Dielektrophoresekraft und des Stokes 'Widerstandskraft diktieren die translatorische Bewegung eines Teilchens.
Wir haben Vorrichtungen für den Betrieb in zwei Frequenzbereichen entwickelt. Höhere frequency-Geräte (100-600 kHz) betrieben haben mit pDEP und erzielte Batch Sortierung von Zellen, wie Prostata-Tumor initiierende Zellen (TIC), Eierstock-Maus-Oberfläche Epithelzellen (MOSE)-Zellen, MDA-MB-231 Brustkrebszellen oder leben THP -1 Zellen durch selektive Fang Zellen von Interesse auf isolierenden Beiträge im Probenkanal befindet. 28-31 Niederfrequenz (5-100 kHz) Geräte arbeiten kontinuierlich, und wenn bei einer Frequenz betrieben, zu dem eine Bevölkerung erfährt pDEP während die Bevölkerung Erfahrungen Hintergrund nDEP kann Teilchenbahnen umleiten Sortierung zu erzielen. 32-34 Diese Niederfrequenz-Geräte wurden verwendet, um Krebszellen zu sortieren von roten Blutzellen zu bestimmen, die Veränderungen der dielektrischen Eigenschaften einer progressiven MÖSE Zelllinie, und um die Auswirkungen von nicht-aufzuklären toxischen Sphingolipid Behandlungen auf Umkehr aggressiven Eigenschaften von aggressiven MOSE Zellen. Zusätzlich kann cDEP Mikrovorrichtungen ausgelegt sein, um einen erhöhten Durchsatz zu arbeiten, derzeit bis zu 1 ml / hr. 31,35
Wie beschrieben, wird die Flexibilität und die geringen Kosten des Herstellungsprozesses ermöglicht eine kundenspezifische Vorrichtungsgeometrien, die die vorgelegten experimentellen Verfahren für eine Vielzahl von Anwendungen relevant sein können. Das langfristige Ziel ist es, cDEP markierungsfreien Zellsortierung und Bereicherung auf einem klinischen Niveau zu realisieren, mit Probenrückgewinnung für die nachfolgende Kultur-oder Verarbeitung. Das hier vorgestellte Verfahren ist ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von Experimenten, welche die Zugänglichkeit von DEP erhöht. Wir zeigen die Herstellung eines cDEP Chip und das Versuchsprotokoll, um die Charakterisierung und Anreicherung von Eierstockkrebszellen von fluoreszierenden Mikrosphären zu erreichen.
DEP ist eine leistungsfähige Technik zur Bestimmung von dielektrischen Eigenschaften von Partikeln und Partikelbewegung in Richtung Regie Sortierung, Trennung oder Anreicherung Anwendungen. Wegen der nachteiligen Wirkung der direkten Elektrodenkontakt mit einer Probe, andere ähnlich dem zuvor dargestellten Verfahren, um den Kontakt zu vermeiden Ansätze gemacht. Zum Beispiel Bashir et al. Durch die Verwendung eines mikrofluidischen PDMS-Gerät aus der Leiterplattenelektroden mit einer dünnen Deckglas getrennt entwickelt berührungsfreie DEP-Geräte, und diese Technik wird auch in Video-Format gemacht. 23,36
Hier haben wir die Herstellung einer Chip cDEP und fluidischen Elektroden unter Verwendung einer einzigen PDMS-Substrat und die Versuchsprotokoll zum Trennen Eierstockkrebszellen aus einer Mischung von Zellen und fluoreszierenden Beads gezeigt. Das vorgestellte Verfahren wurde erfolgreich für eine Vielzahl von komplexeren und physiologisch relevante Anwendungen, einschließlich Sortierung liv verwendete und toten Zellen, 28 tumorauslösende Zellen von Prostata-Krebszellen, 30 Krebszellen aus verdünnten roten Blutkörperchen, 31,32 und Differenzierung unter den Stadien von Brustkrebs 37 und Eierstockkrebs. cDEP 29 ist auch für Mischpartikel verwendet. Diese 38 Anwendungen zeigen, dass durch die Verwendung der einfachen Technik dargestellt, unterschiedliche Zwecke kann einfach durch Veränderung der Gestaltung der Kanalgeometrie erreicht werden.
. DEP ist nützlich im Mikro zur Manipulation von Teilchen 13 Für kugelförmige Teilchen hängt die Translations dielektrophoretische Kraft auf die Größe und elektrischen Eigenschaften der Partikel und ihrer Suspensionsmedium sowie der Gradient des elektrischen Feldes im Quadrat:
wobei ε m die Dielektrizitätskonstante des Suspensionsmediums ist, r der Radiusdes Teilchens, und Rc [k (ω)] ist der Realteil des Clausius-Mossotti (CM)-Faktor. Die CM-Faktor ist ein Maß für die relative Polarisierbarkeit des Teilchens gegenüber dem Suspensionsmedium und bestimmt die Richtung der dielektrophoretischen Kraft. Es wird, wie beschrieben,
wo und die komplexen Permittivitäten des Teilchens und des Mediums sind. Die komplexe Dielektrizitätskonstante, , Hängt Leitfähigkeit (σ) und der Frequenz (ω). Die CM-Faktor von sphärischen Teilchen theoretisch zwischen -0.5 und 1 gebunden. Wenn der CM-Faktor negativ, erfahren die Teilchen nDEP, weil das Medium mehr als die Partikel polarisierbaren, also Teilchen bewegen sich weg von Regionenhohe elektrische Feld Steigungen. Wenn der CM-Faktor positiv ist, sind die Teilchen mehr als polarisierbare Medium und sie pDEP, in dem sie zu Regionen mit hoher elektrischer Feldgradienten bewegen zu erleben.
Für biologische Partikel, die in nicht-homogenen Struktur sind, wie Zellen, kann das Clausius-Mossotti Faktor von einer effektiven Wert für die Partikel Permittivität bestimmt werden:
wo und sind die komplexe Dielektrizitätskonstante der effektiven komplexen Permittivität des Inneren der Zelle, wie z. B. im Zytoplasma, und der Plasmamembran sind;. r der Radius der Zelle ist, und d die Dicke der Plasmamembran 26
Wenn DEP tritt mit Partikeln in eine abgehängteFlüssigkeit, die Bewegung der Partikel relativ zu der Flüssigkeit eine Widerstandskraft auf die Partikel zu erzeugen. Diese Widerstandskraft muss bei der Bestimmung der Gesamtkraft auf die Teilchen wirken werden. Für die Situationen, die hier von Interesse, viskose Kräfte dominieren und Partikel davon ausgegangen, kugelförmig, klein, und bewegt sich mit relativ geringer Geschwindigkeit, so Stokes 'drag Gesetz sieht eine gute Näherung für die Widerstandskraft:
wobei η die Viskosität der Flüssigkeit ist, u p die Geschwindigkeit des Teilchens und u f die Geschwindigkeit des Fluids, das auch bewegen kann. Angesichts der Dielektrophoresekraft, bekannt Fluid-und Partikeleigenschaften, und eine bekannte Strömungsgeschwindigkeit kann die Balance zwischen der Widerstandskraft und dem Dielektrophoresekraft gelöst werden, um die Partikelgeschwindigkeit zu schätzen. Die Scherrate, die die Zellen Erfahrung sollte unter der Schwelle liegen, bei der cell Lyse auftreten können.
Charakterisierung der elektrischen Eigenschaften von Teilchen notwendig ist, vorherzusagen und zu steuern, wie sie unter DEP reagieren sie. In dieser Arbeit, die wir speziell niedrige Frequenz genutzt cDEP mit MOSE-L-Zellen, um das Protokoll für die Bestimmung ersten Crossover-Frequenz von Zellen zu demonstrieren, und dann zeigte kontinuierliche Sortierung von Polystyrol-Kügelchen und MOSE-L-Zellen auf der Basis ihrer gegenüberliegenden DEP Antworten.
Veränderung der Geometrie der cDEP Gerät die räumlichen Gradienten des elektrischen Feldes für die hohe Selektivität und Effizienz von Sortier für einen bestimmten Zelltyp zu ändern, so dass Vorrichtungen zur Hochfrequenz-oder Niederfrequenzbetrieb ausgelegt werden kann, und. Zusätzlich können Hochdurchsatz-Geräten durch Herstellen breitere Kanäle entwickelt werden 30 Kanäle parallel, 30 oder durch Mehrschichtherstellungs 35, bei der die Elektrodenkanäle vertikal oberhalb und unterhalb eines relativ tiefen gestapeltenProbenkanal. Dünne Membranen bilden die Barriere zwischen den Schichten. Vorläufige Tests mit Geräten in Polymethylmethacrylat (PMMA) und Polycarbonat hergestellt (PC)-Dünnfilme haben DEP Antwort von MOSE-L-Zellen demonstriert. Die derzeitigen Bemühungen sind im Gange, um Mehrschicht-Hochdurchsatz-Geräte zu verfeinern und die Peripheriesystems in Richtung einer möglichen Plug-and-Play-Plattform zu verbessern. Um aus der Grund experimentelle Technik vorgestellt erweitern, können die Anwendungen und Daten des Gerätes zugeschnitten auf besondere Anforderungen, wie z. B. Sortieren gegen Charakterisierung, oder das Hinzufügen von Probenbehältern und einem halbautomatisches System an das Gerät angepasst werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt wurde von der National Science Foundation unter Grant No EFRI 0938047 und von der Virginia Tech-Institut für Kritische Technik und Angewandte Informatik (ICTAS) unterstützt. Die Autoren möchten die Wertschätzung Dr. Eva Schmelz und Dr. Paul Roberts für die freundliche Gabe des MOSE-L-Zellen exprimieren. Die Autoren danken Angela Anderson für ihre Hilfe bei der Zellkultur, Caitlan Swaffar für ihre Hilfe bei der Bearbeitung dieses Dokument und die Vorbereitung Experimente und Laborsysteme aller Bioelectromechanical Mitglieder.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI,USA | Sylgard 184 | |
Glass slides | The Microscope Depot | 76079 | 2×3 inch-ground edges |
Microbore PTFE Tubing | Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA | EW-06417-31 | Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll |
Luer-slip plastic syringes | National Scientific company | S7510-1 | |
Needle tip | Howard Electronic instruments | JG20-1.0 | 20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″ |
D(+)-Sucrose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S3-500 | |
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous | Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ | AC410955000 | |
RPMI-1640 Medium | Quality Biological Inc. | 112-025-101 | |
Calcein AM, Molecular Probes | Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA | C3100MP | excitation wavelength 488/emission wavelength 516 |
Rhodamine B, O | Science Lab | SLR1465-100G | excitation wavelength 540/emission wavelength 625 |
Phosphate buffered saline (10X) | Gbiosciences, St. Louis, MO | RC-147 | |
Leica, inverted light microscope | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DMI 6000B | |
Leica DFC420, color camera | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DFC420 | |
Function generator | GW Instek, Taipei, Taiwan | GFG-3015 | |
Wideband power amplifier | Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA | AL-50HF-A | |
HFHV Output Transformer | AL-T50-V25/300-F100K-600K | ||
High voltage amplifier | Trek | Model 2205 | |
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz | AgilentTechnologies | U2701A | |
Expanded Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001/002 (115/230V) | air plasma |
Scotch Magic tape | 3M | any available width is sufficient | |
1.5 mm puncher | Harris Uni-Core | Z708836-25EA | |
.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
FluoSpheres Sulfate Microspheres | Invitrogen | F8858 | 4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605) |
AZ 9260 photoresist | AZ Electronic Materials | ||
AZ 400 K developer | AZ Electronic Materials | ||
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25% | provided by Virginia Tech cleanroom | ||
Teflon coating | applied using DRIE machine | ||
Silicon wafer | University Wafer | 452 | 100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP) |
Deep Reactive Ion Etching (DRIE) | Alcatrel | AMS SDE 100 |