Summary

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Published: July 10, 2013
doi:

Summary

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Abstract

Bioprinting é uma tecnologia emergente que tem suas origens na indústria de prototipagem rápida. Os diferentes processos de impressão pode ser dividido em contacto bioprinting 1-4 (extrusão, mergulho caneta e de litografia suave), sem contacto bioprinting 5-7 (transferência para a frente de laser, de jacto de tinta de deposição) e técnicas baseadas em laser de dois fotões, tais como fotopolimerização 8. Ele pode ser usado para muitas aplicações de engenharia de tecidos, tais como 9-13, 14-16 e microfabricação biossensor, como uma ferramenta para responder a perguntas biológicos básicos, tais como as influências da co-cultura de diferentes tipos de células 17. Ao contrário dos métodos de fotolitografia ou litografia suave comuns, bioprinting extrusão tem a vantagem de que ele não requer uma máscara ou um selo separado. Utilizando software de CAD, o desenho da estrutura pode ser rapidamente alterada e ajustada de acordo com os requisitos do operador. Isto faz bioprinting mais flexível do que com base em litografiaabordagens.

Aqui demonstramos que a impressão de um molde de sacrifício para criar uma estrutura em 3D de multi-material com uma matriz de pilares no interior de um hidrogel, como um exemplo. Esses pilares podem representar estruturas ocas de uma rede vascular ou os tubos dentro de um guia de canal do nervo. O material escolhido para o molde sacrificial foi poloxamer 407, um polímero thermoresponsive com excelentes propriedades de impressão, que é líquido a 4 ° C e um sólido acima da sua temperatura de gelificação ~ 20 ° C para soluções de 24,5% p / v de 18. Esta propriedade permite que o molde de sacrifício à base de poloxâmero ser eluída sob demanda e tem vantagens sobre a dissolução lenta de um material sólido, principalmente para geometrias estreitas. Poloxero foi impressa em lâminas de vidro de microscópio para criar o molde sacrificial. A agarose foi pipetada para dentro do molde e arrefecida até a gelificação. Após eluição do poloxâmero em água gelada, os espaços vazios no molde de agarose foram preenchidos com alginato metacrilato spiked fibrinogénio marcado com FITC. Os vazios cheios foram então reticuladas com UV e a construção foi fotografada com um microscópio epi-fluorescência.

Introduction

Abordagens de engenharia de tecidos têm feito grandes progressos nos últimos anos no que diz respeito à regeneração de tecidos e órgãos humanos 19,20. No entanto, até agora, o foco de engenharia de tecidos tem sido geralmente limitada a tecidos que têm uma estrutura simples ou de pequenas dimensões, como a bexiga ou a pele 21,22 23-25. O corpo humano, no entanto, contém muitos tecidos tridimensionais complexas onde células e matriz extracelular são arranjados de um modo espacialmente definido. Para a fabricação desses tecidos, é necessária uma técnica que possa colocar andaimes células e matriz extracelular num construto tridimensional em posições especificadas. Bioprinting tem o potencial de ser uma técnica em que a visão de fabricação de tecidos tridimensionais complexos podem ser realizados 10,11,26-28.

Bioprinting é definida como "o uso de processos de transferência de materiais para padronização e montagem biologicamente relmateriais levantes – moléculas, células, tecidos e biomateriais biodegradáveis ​​-., com uma organização prescrita para realizar uma ou mais funções biológicas "4 Ela engloba várias técnicas diferentes que funcionam em diferentes resoluções e escalas de comprimento, que vão desde a resolução sub-micron de dois -fotão de polimerização 29 com uma resolução de 150 um a 420 mm para a impressão de extrusão 1,12,30. Nem um único material ou combinação de materiais que satisfazem os requisitos de cada método 31. Para a impressão de extrusão, os parâmetros principais são a viscosidade e o tempo de gelificação 32, onde a elevada viscosidade e gelificação rápida são desejáveis.

Impressão 3D é uma técnica que permite a fácil criação de moldes sacrificiais para a criação de geometrias complexas 30,33,34. Este processo baseia-se na construção de um molde usando uma técnica de prototipagem rápida, tal como um bioprinter extrusão. O molde sacrificial criado é usadode modo a formar estruturas complexas, a partir de materiais que são difíceis de imprimir devido à sua baixa viscosidade e o tempo de gelificação lenta. O método aqui apresentado envolve a criação de um molde sacrificial consistindo de um material que se dissolve rapidamente a uma temperatura baixa e pode ser extrudida com precisão. O copolímero em bloco de poli (etileno-glicol) 99-poli (propileno glicol) 67-poli (etileno-glicol) 99 (também conhecido como o Pluronic F127 ou poloxâmero 407) cumpre estes requisitos. Já foi utilizada uma versão modificada na impressão de extrusão 1, mas, para o nosso conhecimento, nunca foi usado para imprimir na sua versão inalterada, devido à sua instabilidade em ambientes líquidos. Poloxero 407 também apresenta um comportamento não responsivo térmica inversa 18 ou seja ela muda de um gel para um sol durante o arrefecimento. Mais importante, ele pode ser impresso nas estruturas curvadas arbitrariamente complexas com elevada fidelidade. Isso permite a criação de uma estrutura a partir de um hidrogelmaterial de baixa viscosidade, neste caso, de gelificação lenta de agarose, pipetando-se a solução para dentro do molde sacrificial impressa. A combinação de impressão do molde de sacrifício com alta fidelidade e sua eluição rápida do hidrogel estruturado fundido torna um método rápido e flexível para criar moldes com geometrias diferentes, sem o uso de uma máscara ou um selo, uma vez que é muitas vezes necessário em métodos de litografia. O hidrogel estruturado fundido pode ser ainda cheio com outro material que não é adequado para a impressão de extrusão, devido a sua baixa viscosidade. Isto é, no nosso caso uma solução de alginato de metacrilato de baixa viscosidade. Aqui apresenta-se o método de moldes sacrificiais invertidas thermoresponsive para padronização de hidrogel, utilizando o exemplo de uma matriz de coluna.

Protocol

1. Preparação da solução de Poloxamer 407 Se estiver disponível, realizar a preparação da solução poloxamero em uma câmara fria (4 ° C). Se não estiver disponível, o lugar de uma garrafa de vidro de um recipiente cheio de água gelada. A temperaturas mais elevadas, o poloxâmero estará acima do ponto de gel e não se dissolvem bem. Adicionar 60 ml de solução de PBS frio de gelo numa garrafa de vidro e agita-se vigorosamente com um agitador magnético. Pes…

Representative Results

Os resultados representativos mostram que a técnica de molde reversa (ilustrado na Figura 2), vai criar um gel estruturado que pode ser preenchido com um segundo material. No início de cada processo de impressão os parâmetros de impressão são optimizados em primeiro lugar. Ajustamentos faseada dos parâmetros irão resultar em camadas múltiplas impressas construções representadas na Figura 3 e na Figura 4, quando as linhas individuais são impressos. Se a espes…

Discussion

Apresentamos aqui, pela primeira vez, o uso de um polímero para um molde thermoresponsive sacrificial que podem ser rapidamente eluída em água fria, devido à transição gel-sol de poloxâmero de ~ 20 ° C. A velocidade de todo o processo torna poloxâmero interessante para a criação rápida de estruturas de biopolímeros, que não podem ser impressas com uma resolução adequada. A técnica aqui descrita pode ser usado para modelar um hidrogel dentro de um outro ou de hidrogel para a criação de canais microflui…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Deborah Studer pela ajuda com o bioprinter.

O trabalho foi financiado pelo Programa da União Europeia Sétimo Programa-Quadro (FP7/2007-2013), sob acordo de subvenção n ° NMP4-SL-2009-229292.

Materials

REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

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Cite This Article
Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

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