قوالب الطباعية عكس Thermoresponsive لإنشاء منقوشة الهلاميات المائية ثنائي مكون للثقافة الخلية 3D
Summary
تم استخدام bioprinter لخلق الهلاميات المائية منقوشة على أساس العفن فداء. تم ردم القالب بولوكسامير مع هيدروجيل الثاني، ثم مزال، وترك الفراغات التي كانت مليئة هيدروجيل الثالث. يستخدم هذا الأسلوب شطف سريع والقابليه جيدة من بولوكسامير لتوليد أبنية معقدة من البوليمرات الحيوية.
Abstract
Bioprinting هو التكنولوجيا الناشئة التي جذوره في صناعة النماذج الأولية السريعة. عمليات الطباعة المختلفة يمكن تقسيمها إلى bioprinting الاتصال 1-4 (البثق، وتراجع القلم والطباعة الحجرية الناعمة)، تماس bioprinting 5-7 (نقل إلى الأمام ليزر، ترسب الحبر النفاث) والتقنيات القائمة على الليزر مثل اثنين من الفوتون بلمرة ضوئية المنشأ 8. ويمكن استخدامه في العديد من التطبيقات مثل هندسة الأنسجة 9-13، 14-16 والتصنيع الدقيق جهاز الاستشعار البيولوجي كأداة للرد على أسئلة بيولوجية أساسية مثل التأثيرات من شارك في زراعة أنواع مختلفة من الخلايا 17. خلافا لأساليب الطباعة التصويرية أو لينة الطباعة الحجرية المشتركة، bioprinting قذف لديه ميزة أنه لا يحتاج إلى قناع منفصلة أو ختم. باستخدام CAD البرمجيات، وتصميم هيكل يمكن أن تتغير بسرعة وتعديلها وفقا لمتطلبات المشغل. هذا يجعل bioprinting أكثر مرونة من القائم الطباعة الحجريةالنهج.
نحن هنا لشرح الطباعة من العفن فداء لإنشاء بنية 3D متعددة المواد باستخدام مجموعة من الأعمدة داخل هيدروجيل كمثال على ذلك. هذه الركائز يمكن أن تمثل هياكل جوفاء لشبكة الأوعية الدموية أو الأنابيب داخل قناة دليل العصب. كانت المواد المختارة للقالب الذبيحه بولوكسامير 407، البوليمر thermoresponsive مع خصائص الطباعة ممتازة الذي يوجد سائلا عند 4 ° C ومادة صلبة فوق درجة حرارة دبق لها ~ 20 درجة مئوية لمدة 24.5٪ W / V حلول 18. هذه الخاصية تسمح للقالب الذبيحه المستندة إلى بولوكسامير إلى أن مزال على الطلب ولها مزايا أكثر من تفكك البطيء للمادة الصلبة وخاصة بالنسبة للهندستها الضيقة. وقد طبع بولوكسامير على الشرائح الزجاجية المجهر لإنشاء قالب فداء. كان pipetted الاغاروز في قالب ويبرد حتى دبق. بعد شطف من بولوكسامير في الماء البارد الجليد، وملئت الفراغات في القالب الاغاروز مع الجينات ميتاكريليت SPIKED مع FITC الفيبرينوجين المسمى. وبعد ذلك عبر ربط فراغات مملوءة الأشعة فوق البنفسجية وتم تصويرها في بناء مع مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان.
Introduction
جعلت نهج هندسة الأنسجة تقدما كبيرا خلال السنوات الماضية فيما يتعلق تجديد الأنسجة والأعضاء البشرية 19،20. ومع ذلك، حتى الآن، والتركيز على هندسة الأنسجة كثيرا ما كان يقتصر على الأنسجة التي لديها بنية بسيطة أو أبعاد صغيرة مثل المثانة 21،22 أو الجلد 23-25. جسم الإنسان، ومع ذلك، يحتوي على العديد من الأنسجة معقدة ثلاثية الأبعاد حيث يتم ترتيب الخلايا والمصفوفة خارج الخلية بطريقة محددة مكانيا. لتصنيع هذه الأنسجة، مطلوب تقنية يمكن وضع الخلايا والسقالات المصفوفة خارج الخلية ضمن بناء ثلاثي الأبعاد في مواقع محددة. Bioprinting لديه القدرة على أن تكون هذه التقنية حيث الرؤية من تصنيع الأنسجة معقدة ثلاثية الأبعاد يمكن أن تتحقق 10،11،26-28.
يتم تعريف Bioprinting بأنها "استخدام عمليات نقل المواد عن الزخرفة وتجميع يختلط بيولوجياالمواد evant – الجزيئات والخلايا والأنسجة، والمواد الحيوية القابلة للتحلل -. مع منظمة المقررة لإنجاز واحد أو أكثر من الوظائف البيولوجية "4 وهو يشمل العديد من التقنيات المختلفة التي تعمل في مختلف القرارات وجداول الطول، بدءا من قرار اللجنة الفرعية ميكرون من اثنين سوف الفوتون البلمرة 29 إلى قرار من 150 ميكرون إلى 420 ميكرون للطباعة قذف 1،12،30. ليس مادة واحدة أو تركيبة المواد تلبية متطلبات كل طريقة 31. للطباعة البثق، المعلمات الرئيسية هي اللزوجة والوقت دبق 32، حيث اللزوجة العالية ودبق السريع ومرغوب فيه.
3D الطباعة هو الأسلوب الذي يسمح لخلق سهلة من قوالب فداء لخلق هندستها معقدة 30،33،34. ويستند هذا على عملية بناء قالب باستخدام تقنية النماذج الأولية السريعة مثل bioprinter قذف. يتم استخدام قالب الأضاحي إنشاؤهالتشكيل هياكل معقدة من المواد التي يصعب طباعتها بسبب اللزوجة المنخفضة وبطء وقت دبق. الطريقة المعروضة هنا ينطوي على إنشاء قالب الذبيحه التي تتكون من المواد التي يذوب بسرعة في درجة حرارة منخفضة ويمكن أن يكون مقذوف بدقة. كتلة كوبوليمر بولي (جلايكول الإثيلين) 99 بولي (البروبيلين جليكول) 67 بولي (جلايكول الإثيلين) 99 (المعروف أيضا باسم بلورونيك F127 أو بولوكسامير 407) يستوفي هذه المتطلبات. وقد تم بالفعل استخدامه في نسخة معدلة في الطباعة قذف 1، ولكن على حد علمنا، لم يتم استخدامها لطباعة نسخة معدلة في لها بسبب عدم الاستقرار في البيئات السائلة. بولوكسامير 407 يظهر أيضا استجابة السلوك الحراري معكوس 18 أي أن يتحول من هلام لسول على التبريد. الأهم من ذلك، فإنه يمكن أن تكون مطبوعة في هياكل منحنية بشكل تعسفي معقدة مع الدقة العالية جدا. وهذا يسمح للإنشاء هيدروجيل منظم منمنخفض اللزوجة المواد، في هذه الحالة بطيء التبلور الاغاروز، من قبل pipetting الحل في القالب الذبيحه المطبوعة. مزيج من الطباعة القالب الذبيحه مع الدقة العالية وشطف سريع لها من هيدروجيل منظم مسبوكة يجعل من وسيلة سريعة ومرنة لإنشاء قوالب مع هندستها مختلفة دون استخدام قناع أو طابع بقدر ما هو مطلوب منها في أساليب الطباعة الحجرية. هيدروجيل منظم مسبوكة يمكن ملء مع مزيد من مادة أخرى غير مناسبة للطباعة قذف بسبب اللزوجة منخفضة. هذا هو في حالتنا الجينات اللزوجة المنخفضة حل ميتاكريليت. هنا نقدم طريقة thermoresponsive قوالب الذبيحه العكسي لتنميط هيدروجيل باستخدام المثال من مجموعة عمود.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم، لأول مرة، واستخدام البوليمر thermoresponsive لقالب الذبيحه التي يمكن مزال بسرعة في الماء البارد بسبب الانتقال هلام سول من بولوكسامير من ~ 20 درجة مئوية. سرعة العملية برمتها يجعل بولوكسامير مثيرة للاهتمام لخلق السريع للهياكل البوليمر الحيوي الذي لا يمكن طباعتها مع ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ديبورا شتودر للمساعدة مع bioprinter.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) تحت منحة اتفاق N ° NMP4-SL-2009-229292.
Materials
| REAGENTS | |||
| Poloxamer (Pluronic F127) | Sigma | P2443 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-015 | |
| CAD software | regenHU | BioCAD | |
| Alginate methacrylate | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | F13191 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| EQUIPMENT | |||
| Bioprinter | regenHU | Biofactory | |
| Valve | regenHU | 300 μm Nozzel Diameter | |
| Needle | regenHU | 150 μm Inner Diameter | |
| Zeiss Axioobserver with ApoTome | Zeiss | ||
| UV Light Source | UVP | Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp | 100 W |
References
- Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
- Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
- Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
- Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
- Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
- Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
- Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
- Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
- Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).
- Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. , 82-85 (2009).
- Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
- Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
- Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin’oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
- Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
- Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
- Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering–in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
- Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
- Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
- He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
- Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
- Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
- Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
- Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).
- Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
- Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
- D’Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
- Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
- Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).
