Summary

Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Published: July 10, 2013
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Summary

Ein bioprinter wurde verwendet, um strukturierte Hydrogele auf einem Opfer-Form zu erstellen. Das Poloxamer Form wurde mit einem zweiten Hydrogel verfüllt und dann eluiert, so dass Hohlräume, die mit einem dritten Hydrogel gefüllt wurden. Diese Methode verwendet schnelle Elution und gute Bedruckbarkeit von Poloxamers zu komplexen Architekturen aus Biopolymeren zu generieren.

Abstract

Bioprinting ist eine neue Technologie, die ihre Ursprünge in der Rapid-Prototyping-Branche hat. Die verschiedenen Druckverfahren in Kontakt Bioprinting 1-4 (Extrusion, Dip-Pen und weiche Lithographie), kontaktlose Bioprinting 5-7 (Vorwärtstransfer Laser-, Tintenstrahl-Abscheidung) und Laser-basierte Techniken wie Zwei-Photonen Photopolymerisation 8 aufgeteilt werden. Es kann für viele Anwendungen wie Tissue Engineering 9-13, 14-16 und Biosensor microfabrication als Instrument genutzt werden, um grundlegende biologische Fragen, wie Einflüsse von Co-Kultivierung verschiedener Zelltypen 17 beantworten. Anders als bei herkömmlichen Photolithographie oder Soft-lithographischen Methoden, hat Extrusion Bioprinting den Vorteil, dass es nicht erforderlich, eine separate Maske oder Stempel. CAD-Software verwenden, kann das Design der Struktur schnell verändert und entsprechend den Anforderungen des Betreibers eingestellt werden kann. Dies macht Bioprinting flexibler als Lithographie-basiertenAnsätze.

Hier zeigen wir, das Drucken eines Opfer-Form, um ein Multi-Material-3D-Struktur mit einer Reihe von Säulen in einem Hydrogel als Beispiel zu erstellen. Diese Säulen konnte hohlen Strukturen für eine vaskuläre Netzwerk oder die Rohre innerhalb eines Nervenleitschiene Leitung zu vertreten. Das Material für die Opferschicht Form gewählt wurde, Poloxamer 407, ein thermoresponsive Polymer mit hervorragenden Druckeigenschaften, die flüssig ist bei 4 ° C und eine feste oberhalb ihrer Geliertemperatur ~ 20 ° C 24,5% w / v Lösung 18. Diese Eigenschaft ermöglicht die Poloxamer-basierte Opferschicht Form auf Verlangen eluiert und hat Vorteile gegenüber der langsamen Auflösung eines festen Materials besonders bei schmalen Geometrien. Poloxamer wurde am Mikroskop Glasträger gedruckt, um die Opfer-Form zu erstellen. Agarose wurde in die Form pipettiert und abgekühlt, bis die Gelierung. Nach der Elution der Poloxamer in eiskaltem Wasser wurden die Hohlräume in der Form mit Alginat Agarose Methacrylat sp gefülltiked mit FITC markiertes Fibrinogen. Die gefüllten Hohlräume wurden dann mit UV-vernetzt und das Konstrukt wurde mit einem Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop abgebildet.

Introduction

Tissue Engineering Ansätze haben große Fortschritte in den letzten Jahren in Bezug auf Regeneration von menschlichen Geweben und Organen 19,20. Doch bis jetzt hat sich der Schwerpunkt des Tissue Engineering wurden oft zu den Geweben, die eine einfache Struktur oder kleinen Abmessungen wie die Blase 21,22 oder der Haut haben 23-25 ​​begrenzt. Der menschliche Körper enthält jedoch viele komplexe dreidimensionale Gewebe, wo Zellen und der extrazellulären Matrix in einem räumlich definierten Weise angeordnet sind. Um diese Gewebe herzustellen, ist eine Technik erforderlich, die Zellen und der extrazellulären Matrix Gerüst in einer dreidimensionalen Konstrukt an bestimmten Stellen zu platzieren. Bioprinting hat das Potential, ein solches Verfahren, bei dem die Vision Herstellung komplexer dreidimensionaler Gewebe 10,11,26-28 realisiert werden kann.

Bioprinting wird als "der Verwendung von Material Transfer-Prozesse zur Strukturierung definiert und Montage biologisch relvanten Materialien – Moleküle, Zellen, Gewebe und biologisch abbaubaren Biomaterialien -. einem vorgeschriebenen Organisation an einen oder mehrere biologische Funktionen "4 erreichen Sie umfasst verschiedene Techniken, die Arbeit in verschiedenen Auflösungen und Längenskalen, von der Sub-Mikrometer-Auflösung von zwei -Photonen-Polymerisation 29 mit einer Auflösung von 150 bis 420 um für die Extrusion Druck 1,12,30. Nicht ein einziges Material oder Material-Kombination wird den Anforderungen der jeweiligen Methode 31 zu erfüllen. Für Extrusion Druck, sind die wichtigsten Parameter Viskosität und Gelierdauer 32, wo eine hohe Viskosität und eine schnelle Gelierung wünschenswert.

3D-Druck ist eine Technik, die die einfache Erstellung von Opfer-Formen für die Erstellung von komplexen Geometrien erlaubt 30,33,34. Dieses Verfahren beruht auf der Konstruktion einer Form unter Verwendung einer Rapid Prototyping Technik, wie eine Extrusion bioprinter basiert. Die erstellte Opfer Form verwendet wird, komplexe Strukturen aus Materialien, die schwer zu aufgrund ihrer niedrigen Viskosität und Gelierzeit langsam gedruckt sind bilden. Das hier vorgestellte Verfahren betrifft die Schaffung eines Opfer-Form, die aus einem Material, das schnell löst bei niedriger Temperatur und extrudiert werden kann, genau. Das Block-Copolymer Poly (ethylenglycol) 99-Poly (Propylenglykol) 67-Poly (ethylenglykol) 99 (auch als Pluronic F127 oder Poloxamer 407 bekannt) erfüllt diese Anforderungen. Es wurde bereits in einer modifizierten Version der Extrusion Druck 1 verwendet worden, aber nach unserem Wissen, hat noch nie für den Druck in ihrer unmodifizierten Fassung aufgrund seiner Instabilität in flüssigen Umgebungen eingesetzt. Poloxamer 407 zeigt ebenfalls eine inverse thermische Ansprechverhalten 18 also Änderungen von einem Gel zu einem Sol nach dem Abkühlen. Vor allem aber können sie in komplexe beliebig gekrümmte Strukturen mit sehr hoher Genauigkeit gedruckt werden. Dies ermöglicht die Schaffung eines strukturierten Hydrogel aus einemMaterialien mit niedriger Viskosität in diesem Fall langsam gelierende Agarose durch Pipettieren der Lösung in der gedruckten Form Opferschicht. Die Kombination aus dem Drucken des Opfer-Form mit hoher Wiedergabetreue und ihre praktischen Elution aus dem gegossenen strukturierten Hydrogels ermöglicht eine schnelle und flexible Verfahren zur Herstellung von Formen mit unterschiedlichen Geometrien ohne die Verwendung einer Maske oder eines Stempels, wie es oft in lithographischen Verfahren erforderlich erstellen. Die gegossenen strukturierten Hydrogel weiter mit einem anderen Material, das nicht für die Extrusion geeignet Druck aufgrund seiner niedrigen Viskosität gefüllt werden. Dies ist in unserem Fall eine niedrige Viskosität Alginat Methacrylat Lösung. Hier präsentieren wir die Methode des Reverse thermoresponsive Opfer Formen für Hydrogel Strukturierung am Beispiel einer Säule Array.

Protocol

1. Vorbereitung des Poloxamer 407 Lösung Falls vorhanden, führen Sie die Vorbereitung des Poloxamers Lösung in einem kalten Raum (4 ° C). Wenn nicht vorhanden, legen Sie eine Glasflasche in einem Becherglas mit eiskaltem Wasser gefüllt. Bei höheren Temperaturen wird die Poloxamers oberhalb des Gels Punkt und wird nicht richtig auflösen. 60 ml eiskaltem PBS Lösung in einer Glasflasche und rühren kräftig mit einem Magnetrührer. Wiegen 24,5 Gramm Poloxamer und f?…

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Rückform Technik (dargestellt in Abbildung 2) wird eine strukturierte Gel, das mit einem zweiten Material gefüllt werden können. Zu Beginn eines jeden Druckvorgang die Druckparameter werden zunächst optimiert. Stufenweise Anpassung der Parameter werden in gedruckter vielschichtigen Konstrukte in Abbildung 3 und Abbildung 4, wenn einzelne Zeilen gedruckt dargestellt führen. Wenn die Schichtdicke (die Nadelhub nach ein…

Discussion

Hier stellen wir zum ersten Mal die Verwendung eines thermosensitiven Polymeren nach einem Opfer-Form, die sich schnell in kaltem Wasser kann durch die Gel-Sol-Übergang von Poloxamer von ~ 20 ° C eluiert Die Geschwindigkeit des gesamten Prozesses macht Poloxamers interessant für die schnelle Erstellung von Biopolymer Strukturen, die nicht mit ausreichender Auflösung gedruckt werden kann. Die hier beschriebene Technik kann zur Strukturierung eines Hydrogels in einem anderen Hydrogel oder für die Erstellung von mikro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Deborah Studer für die Hilfe bei der bioprinter.

Die Arbeit wurde von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. NMP4-SL-2009-229292 finanziert.

Materials

REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

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Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

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