Микобактерией лепры, возбудитель проказы, не растет в пробирке. Мы описываем легко следовать протоколу подготовить бактериальная подвеска для обеспечения поддержания большого количества М. лепры для различных приложений. Протоколы для распространения с помощью мыши в подушечку лапы прививки, оценки жизнеспособности, замораживания и оттаивания бактериальной складе подробно описаны.
Проказа, вызванные Mycobacterium лепры, является важным инфекционное заболевание, которое по-прежнему эндемическим во многих странах по всему миру, включая Бразилию. Там в настоящее время нет известных методов для выращивания М. лепры в пробирке, представляя собой серьезное препятствие в изучении этого патогена в лаборатории. Таким образом, техническое обслуживание и рост M. Штаммы лепры предпочтительно осуществляют в бестимусных голых мышей (NU-Foxn1 NU). Лабораторные условия для использования мышей легко доступны, легко выполнить, и позволяют стандартизации и разработку протоколов для достижения воспроизводимых результатов. В настоящем докладе мы описываем простой протокол для очистки бацилл из обнаженных подушечек лап мыши, используя трипсин, который дает суспензию с минимальным мусора клеток и с высокой бактериальной индекса жизнеспособности, как это определено флуоресцентной микроскопии. Модификация стандартного метода для бактериальной подсчета по Циля-Нильсенаокрашивания и световой микроскопии также продемонстрировал. Кроме того, мы опишем протокол для замораживания и оттаивания бациллярных запасов в качестве альтернативного протокола для технического обслуживания и хранения М. штаммы лепры.
Проказа, заболевание, вызываемое микобактериями лепры, является важной проблемой общественного здравоохранения во многих странах по всему миру 1,2. Несмотря на то, известен как инфекционного заболевания, которое влияет как на кожу и периферические нервы, есть еще несколько пробелов в знаниях о механизмах, участвующих в комплексной иммунопатогенезе заболевания.
Среди сложных характеристик М. лепры, которые мешают его изучение является его неспособность расти в искусственных питательных сред и его время относительно долго удвоения (примерно 14 дней) 3,4. Большинство экспериментальных процедур, которые используют М. лепры настроены бациллами очищенных от поражения кожи больных проказой или из экспериментальных моделях на животных, таких, как броненосцы и несколько линий мышей 5,6.
В течение многих лет исследователи зависит от очистки М. лепры от поражения кожи мультибациллярная LeprOsy пациентов для использования в экспериментальных процедур. Несколько лабораторные условия для выращивания в пробирке или поддержания живой М. лепры были попытки, но на сегодняшний день, модели на животных доказали, что наиболее подходит для исследовательских целей. В 1960-х и 1970-х годов, исследователи начали использовать мышей и броненосцы для обнаружения и оценки М. лепры жизнеспособность, мониторинг роста бактерий в ответ на анти-М. лепры препараты, и в росте и поддержании штаммов микобактерий 2,4.
Модели животных имеют некоторые ограничения, особенно в броненосцев и приматов, в том числе этические проблемы, стоимости обслуживания, специальной инфраструктуры, необходимой для обслуживания животных и плохой воспроизводимости результатов и конечных урожайности. В настоящее время, мыши являются предпочтительным животная модель для лепры исследований. Лабораторные условия для использования мышей легко доступны, легко выполнить, и позволяют стандартных протоколов <sup> 7,8,9. Голые мыши были использованы в поддержании M. лепры штаммы, поскольку, даже при низких жизнеспособных бацилл нагрузок, Т-клеточный иммунный ответ с дефицитом приводит к избыточной формирования гранулемы и хорошей бактериальной умножения. Таким образом, эта модель животное получило широкое признание в рамках исследовательского сообщества проказы.
В настоящем докладе мы описываем простой протокол для ферментативного очищения бацилл из обнаженных подушечек лап мыши, предназначен для приготовления М. лепры подвеска с минимальным мусора клеток и с высокой бактериальной индекса жизнеспособности. Жизнеспособность определяется флуоресцентной микроскопии, которые могут быть быстро выполненной в лаборатории. Мы также демонстрируют модификацию со стандартным методом для бактериальной подсчета по холодной Циля-Нильсена окрашивания и световой микроскопии. Кроме того, мы представляем альтернативное протокол для обслуживания и хранения М. штаммы лепры, позволяя замораживание и оттаивание бактериальной улocks.
Подробное описание хорошо показано на чертеже, протокол для успешного распространения M. лепры крайне необходимо. Наше исследование показывает, что протокол подготовки посевной фильтрацией и трипсина пищеварения позволяет посевной должны быть получены с очень мало продуктов распада клеток и с высокой жизнеспособности бактерий (оценка 0 +). Гидроксид натрия был использован для разбивки ткани для очистки бацилл 6. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, используя гидроксид натрия для очистки М. лепры привело к образованию комков бацилл, препятствуя гомогенизации суспензии для определения жизнеспособности и животного прививки (данные не представлены).
Потенциальные проблемы, связанные с приготовления инокулята фильтрованием и трипсин-переваривание включают большое количество клеточных остатков и загрязнения инокулята с бактериальными или грибковыми агентами. В случае больших количеств клеточной Дебрене наблюдаются после очистки, либо трипсин больше не является активным или существует избыточное количество биологического материала. Ферментативной активности трипсина маточного раствора должен быть оценен. Если чрезмерное количество исходного биологического материала подозревается, материал должен быть разделен на аликвоты и протокол должен осуществляться отдельными партиями. Во избежание загрязнения посевного с бактериальной или грибковой агентов, необходимо позаботиться, чтобы обработать материал в асептических условиях. Если грибковые и / или бактериальное загрязнение обнаружено подвеска следует отказаться.
Ограничением нашего протокола является субъективность оценки жизнеспособности с использованием описанного полу-количественный метод. Жизнеспособность оценивали полуколичественно является более практичным, хотя и менее точным, чем опубликованной количественного метода 6. Жизнеспособность оценка 0 + и 1 + являются удовлетворительными для обеспечения распространения и замораживанияМ. лепры. Лахири и др.. уже показали, что голым мышам инокулированные 80-90% жизнеспособных посевного, привести к подушечек лап, пригодных для сбора урожая (высокая жизнеспособность бациллы) на 4-5 месяцев прививки. Таким образом, ранняя инфекция (около 4-х месяцев) это лучшее время сбора урожая. Для уборки замороженного посевного материала, мыши в настоящем Протоколе поддерживались инокулированный на более длительный срок (7 месяцев) по обеспечению кривые роста. Важным шагом для обеспечения адекватного жизнеспособность является использование свежих суспензий бацилл, предпочтительно в течение 24 часов после сбора биологического материала от хоста и обработки. Кроме того, качество реагентов, свежеприготовленные разбавленные трипсина и жизнеспособность окрашивания решения, которые необходимы, чтобы гарантировать воспроизводимые результаты.
Еще одно ограничение этого протокола является то, что в финал М. лепры подвеска не свободна от хозяина ДНК, РНК, белков и т.д.. Таким образом, другие этапы очистки должны быть добавлены то получения М. лепры подвеска содержащей компоненты клетки-хозяина.
Способ поддержания жизнеспособных бактерий путем замораживания целые образцов тканей из М. лепры поражения сообщалось 9. Тем не менее, исследование Portaels и соавт. продемонстрировали значительные потери жизнеспособности, в диапазоне от 65-97% после замораживания и оттаивания М. лепры инфицированных образцов тканей, полученных из броненосца 9. Наш протокол показали, что индекс жизнеспособность наблюдается в М. лепры суспензии после замораживания и оттаивания упал по сравнению с аликвоты, которые не были заморожены (табл. 1). В самом деле, замораживание М. лепры подвеска в морозильных СМИ дали жизнеспособность в диапазоне от 50-70%, с жизнеспособности счетом 1 +, в то время как жизнеспособность оценка 0 + был получен в незамерзшей подвески. Тем не менее, умножение М. лепры было удовлетворительным после 7 месяцев после прививки голых мышей ( <sЧонг> Таблица 1). Инокуляция голых мышей с восстановленных образцов поддерживали замороженное в течение 60 дней привело к средние 100 раз увеличение количества бацилл по сравнению с первоначальной посевного материала. Похоже, что замораживание М. лепры подвеска в замораживания средств массовой информации, а образцов зараженных тканей, является более эффективным. Важным шагом нашего протокола является медленное замораживание САФ в морозильной контейнера, необходимых для поддержания бациллы жизнеспособным, о чем свидетельствует Колстона и Hilson 8. Дальнейшие эксперименты должны быть проведены, чтобы оценить жизнеспособность бактерий после длительного замораживания.
Таким образом, поскольку M. лепры не растет в пробирке, наш протокол позволяет быстро и просто альтернатива для поддержания жизнеспособного посевного и успешным шагом замораживания делает возможным поддержание штаммов без постоянного прохода в животных, что позволяет создание банка определенных штаммов.
Этот раздел содержит инструкции для приготовления реагентов для выполнения этого протокола.
1. Трипсин
Трипсин | 0,5 г |
Дистиллированная вода | до 100 мл |
Фильтр стерилизуют. Хранить при -20 ° С.
2. 7H9
7H9 бульона база | 4,7 г |
40% запаса глицерина | 5 мл |
Дистиллированная вода | до 900 мл |
Смешайте базу водой, затем добавить глицерин при перемешивании. Автоклаве при 121 ° С в течение 20 мин для стерилизации. Хранить при 4 ° С.
3. Мозг сердце настой (BHI)
BHI | 37 г |
Дистиллированная вода | до 1000 мл |
Автоклаве при 121 ° С в течение 15 мин для стерилизации. Хранить при 4 ° С.
4. Фенол сыворотки
4.1) 5% фенола
Фенол | 5 мл |
Дистиллированная вода | до 100 мл |
4.2) Сыворотка фенол
фетальной бычьей сыворотки | 2 мл |
5% фенола | 98 мл |
Хранить при 4 ° С.
5. Решения для холодной Циля-Нильсена Stain
5.1) CarboFuchsin
Фуксин | 1 г |
Кристаллы Фенол, слитый с 60 ° С | 5 мл |
Чистый этиловый спирт | 10 мл |
Дистиллированная вода | до 100 мл |
Фильтр перед каждым использованием.
5.2) Метиленовый синий База
Метиленовый синий | 3 г |
95% этиловый спирт | до 200 мл |
5.3) Алкоголь кислоты
70% алкоголя | 990 мл |
chloridric кислоты | 10 мл |
6. Среда для замораживания:
OADC | 10 мл |
Глицерин | 20 мл |
7H9 среднего | до 100 мл |
Автоклав глицерина перед использованием и стерилизовать OADC путем фильтрации.
7. Автоклавного М. лепры подвеска
Автоклаве при 121 ° С в течение 20 мин. Хранить при -20 ° С.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Беатрис GC Сартори, Lazara М. Trino, Ана Elisa Fusaro и Клаудия PM Карвалью за техническую помощь. Мы благодарим Пранаба К. Дас для оказания поддержки в создании объекта животного. Мы благодарим LAIS RR Costa пересмотра рукопись. Это исследование было поддержано грантами от Fundação Паулиста противопоказаний Hanseníase и Fundação де Ампаро à Pesquisa сделать Estado де Сан-Паулу (FAPESP 2009/06122-5).
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo1°C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova INC | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer – 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |