麻风分枝杆菌,麻风病的病原体,不长在体外 。我们描述一个易于遵循的协议准备杆菌悬液,以确保大量M的保养麻风用于各种应用。协议通过鼠标脚垫接种,可行性评估,冻融杆菌股票的传播进行了详细的描述。
麻风病,引起麻风分枝杆菌,是一种重要的传染病,仍然是流行在世界各地的许多国家,包括巴西。目前用于生长分枝没有已知的方法麻风杆菌在体外 ,呈现在这种病原体在实验室的研究中的一大障碍。因此,M的维持和生长麻风杆菌菌株在无胸腺裸小鼠(NU-Foxn1 NU)优选执行。都是现成的,易于操作的实验室条件下使用鼠标,并允许标准和协议的发展为实现可重复的结果。在本报告中,我们描述了一个简单的协议,用于从使用胰蛋白酶,这将产生一个悬浮最小的细胞碎片和大量细菌生存能力指数裸鼠脚掌杆菌的净化处理,通过荧光显微镜来确定。的修改,对杆菌计数用抗酸标准方法染色和光镜也被证实。此外,我们描述了一种协议,用于冷冻和解冻杆菌种群为维护分枝的和存储的替代协议麻风杆菌菌株。
麻风病,造成麻风分枝杆菌病,是在世界各地的1,2许多国家的一个重要的公共卫生问题。尽管被称为一种传染性疾病,影响皮肤和周围神经,还有几个知识差距所涉及的疾病的免疫病理复杂的机制。
其中M的具有挑战性的特点麻风杆菌阻碍其研究是其不能在人工培养基和其相对较长的倍增时间(约14天)3,4成长。使用M.最具实验性的程序麻风杆菌都设置了杆菌皮损麻风患者或实验动物模型,如犰狳和几个品系的小鼠5,6纯化。
多年以来,研究人员一直依赖于M的净化从麻风皮损多菌LEPR的OSY患者在实验过程中使用。几个实验室条件下在体外培养活分枝的或维护麻风已经尝试,但到目前为止,动物模型中已被证明是用于研究目的的最合适。在20世纪60年代和70年代,研究人员开始利用老鼠和犰狳检测M.和评估麻风杆菌存活率,响应于抗分枝监测细菌的生长麻风药,并在分枝杆菌菌株2,4的 生长和维持。
动物模型有一定的局限性,尤其是在犰狳和非人灵长类动物,包括伦理问题,维护成本,需要对动物特别维护基础设施和结果的可重复性差,最终产量。目前,老鼠是首选的模型动物进行麻风病研究。在实验室条件下,使用鼠标随手可得,易于操作,并允许标准化协议<sup> 7,8,9。裸鼠中M的维护已被用于杆菌菌株,因为即使具有低可行杆菌负载时,T细胞缺陷型免疫反应导致旺盛肉芽肿的形成和良好杆菌乘法。因此,这种动物模型中的麻风病研究领域获得了广泛的认可。
在本报告中,我们描述了一个简单的协议,用于从裸鼠脚掌杆菌的酶纯化,用于制备M的麻风杆菌悬浮液以最小的细胞碎片和具有高细菌存活指数。生存能力是通过荧光显微镜,可以在实验室中被迅速地进行测定。我们还证明变形为杆菌计数由冷抗酸染色和光学显微镜的标准方法。此外,我们提出一个替代协议M.维护和贮存麻风杆菌菌株,使冷冻及杆菌ST解冻ocks。
一个图文并茂,成功的协议,用于M的传播的详细说明麻风杆菌是非常需要的。我们的研究表明,接种物制备的过滤和胰蛋白酶消化的协议允许用很少的细胞碎片,并与杆菌的高存活率得到的接种物(得分0 +)。氢氧化钠已被用来分解该组织为杆菌6的纯化。使用氢氧化钠为分枝的纯化在我们的实验室中进行的研究麻风杆菌导致形成杆菌的团块,阻碍了暂停活力的决心和动物接种(数据未显示)的同质化。
与接种准备通过过滤和胰蛋白酶消化遇到的潜在问题包括大量的细胞与细菌或真菌剂接种的杂物和污染。若大量细胞DEBR的已被纯化后观察到的,无论是胰蛋白酶不再是活动的或有生物材料的过量。胰蛋白酶原液的酶的活性,必须进行评估。如果初始生物材料过量怀疑,该材料应该分成等份并且协议应分批进行。为了避免与细菌或真菌剂的种菌的污染,必须小心,以处理在无菌条件下的材料。如果真菌和/或细菌污染所检测出的悬浮液应该被丢弃。
本协议的限制是可行的评价使用上述半定量方法的主观性。可行性评估的半定量比较实用,虽然比公布的定量方法6不太精确。 0 +和1 +生存能力得分均令人满意,维修传播和冻结麻风杆菌。拉希里等人 。已经表明,接种80-90%可行的接种裸鼠,导致适合于4-5个月接种收获(高生存能力杆菌)脚垫。因此,早期感染(约4个月)是最佳的收获时间。收获冷冻接种后,小鼠,本协议在维持接种的时间较长(6个月),以保证生长曲线。一个关键的步骤,以确保有足够的活力是使用新鲜杆菌悬浮液,优选在收集生物材料从主机和处理后24小时。此外,所用试剂的质量,新鲜制备的稀释胰蛋白酶和活力染色的解决方案,是必要的,以保证可重复的结果。
此协议的另一个限制是,最终的分枝麻风杆菌悬挂是不是免费的宿主DNA,RNA,蛋白质, 等 。因此,其它纯化步骤,必须加入叔Ø获得M。麻风杆菌悬挂自由宿主细胞成分。
一种用于冷冻M的整个组织标本保持存活菌方法麻风病变已经报道9。然而,这项研究由Portaels 等 。证明显著亏损生存能力,之间65-97%不等冻结和M的解冻后麻风杆菌感染的犰狳9获得组织标本。我们的协议表明,在M中观察到的存活指数时相比,并没有被冻结( 表1)的等分试样冷冻和解冻后麻风杆菌悬浮液丢弃。事实上,冻结M。麻风杆菌悬浮冻结的媒体产生了活力,从50-70%,具有活力得分,1 +,而生存能力得分0 +是在解冻停牌获得。然而,M的乘法麻风杆菌是令人满意的7个月后接种后的裸鼠( <sTRONG>表1)。裸鼠接种溶,样品保持冷冻60天导致杆菌数平均100倍的增幅相比初始接种。似乎冻结M.麻风杆菌悬浮液代替感染组织标本在冷冻介质,是更有效的。我们的协议的一个关键步骤是在空军基地的慢速冷冻的冷冻集装箱,就要保持杆菌可行,具体表现为科尔斯顿和Hilson的8。未来的实验将进行较长后,冻结期间,评估杆菌的生存能力。
综上所述,由于M。麻风杆菌不能在体外生长,我们的协议允许快速和容易的替代维护可行的接种物,并成功冻结一步成为可能菌株的维护,无需连续传代的动物,从而使建立定义菌株的一家银行。
本节包含准备试剂执行该协议的指令。
1。胰蛋白酶
胰蛋白酶 | 0.5克 |
蒸馏水 | 至100ml |
过滤消毒。储存在-20℃。
2。 7H9
7H9肉汤基地 | 4.7克 |
40%甘油 | 5毫升 |
蒸馏水 | 达900毫升 |
与水混合基再加入甘油,边搅拌边。在高压灭菌121℃20分钟灭菌。贮存于4℃。
3。脑心脏浸液(BHI)
BHI | 37克 |
蒸馏水 | 达千毫升 |
高压灭菌121℃,15分钟灭菌。贮存于4℃。
4。苯酚血清
4.1)5%苯酚
苯酚 | 5毫升 |
蒸馏水 | 至100ml |
4.2)血清酚
胎牛血清 | 2毫升 |
5%苯酚 | 98毫升 |
贮存于4℃。
5。冷抗酸染色解决方案
5.1)CarboFuchsin
品红 | 1克 |
苯酚晶体融合至60℃ | 5毫升 |
纯乙醇 | 10毫升 |
蒸馏水 | 至100ml |
每次使用前进行筛选。
5.2),亚甲基蓝基地
亚甲基蓝 | 3克 |
95%乙醇 | 最多至200 ml |
5.3)醇酸
70%酒精 | 990毫升 |
chloridric酸 | 10毫升 |
6。介质冻结:
OADC | 10毫升 |
甘油 | 20毫升 |
7H9培养基 | 至100ml |
使用前高压灭菌甘油和经过滤消毒OADC。
7。蒸压M。麻风杆菌悬液
在高压灭菌121℃20分钟。储存在-20℃。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢比阿特丽斯GC萨托利,LázaraM.特里诺,安娜陈洁FUSARO和Claudia下午卡瓦略的技术援助。我们感谢普拉纳布·K.达斯支持建立动物设施。我们感谢LAIS RR哥斯达黎加的修改手稿。这项研究是由来自FUNDAÇÃO保利斯塔禁忌Hanseníase和FUNDAÇÃO德宪法保护的单Pesquisa资金支持做斯卡德圣保罗(FAPESP 2009/06122-5)。
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo1°C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova INC | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer – 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |