マイコバクテリウム·レプラ、ハンセン病の原因因子は、 インビトロで成長しない。我々は、M.大量の維持を確実にするために結核菌懸濁液を調製するためのプロトコルを以下に簡単に説明し様々なアプリケーションのためらい 。桿菌株を凍結融解マウス足蹠接種による伝播のためのプロトコル、生存性の評価は、詳細に記載されている。
らい菌によって引き起こされるハンセン病は、ブラジルなど、世界中の多くの国でまだ流行している重要な感染症である。 M.を成長させるための既知の方法は現在ありませんらい菌のin vitro実験室でこの病原体の研究で大きな障害と提示する。そのため、Mの維持および増殖らい菌の菌株は、好ましくは、無胸腺ヌードマウス(NU-FOXN1ν)で行われる。マウスを用いた実験室条件は、実施が容易で容易に入手可能であり、再現性のある結果を達成するためのプロトコルの標準化および開発を可能にする。蛍光顕微鏡によって決定された本報告書では、最小限の細胞破片と、高細菌の生存率を有する懸濁液が得トリプシンを使用して、ヌードマウスのフットパッドから菌を精製するための単純なプロトコルを記述します。チールネルゼンによる桿菌カウントするための標準的な方法への修正染色し、光学顕微鏡にも実証されている。さらに、我々はMのメンテナンスや保管のための代替プロトコルとして凍結融解桿菌株のためのプロトコルを記述らい菌の菌株。
ハンセン病は、 らい菌によって引き起こされる疾患は、世界の1,2の多くの国で重要な公衆衛生問題である。皮膚や末梢神経の両方に影響を与え、感染症として知られているにもかかわらず、疾患の複雑な免疫病原性に関与する機構についての知識のいくつかのギャップが残っています。
Mの挑戦的な特性のうちその調査を妨げるらい菌は、人工培養培地で増殖することができないことと、比較的長い倍加時間(約14日) の3,4である。 M.を使用するほとんどの実験手順らい菌は、ハンセン病患者の皮膚病変から、あるいはそのようなアルマジロやマウス5,6のいくつかの株のような実験動物モデルから精製菌を使用して設定されています。
何年もの間、研究者はMの精製に依存していますらい菌多細菌性LEPRの皮膚病変から実験手順で使用するためのOSY患者。ライブMのインビトロ培養やメンテナンスのためのいくつかの実験室の条件らい菌が試みられているが、今日まで、動物モデルは、研究目的のために最も適していることが判明した。 1960年代と1970年代に、研究者はMの検出と評価のために、マウスやアルマジロを使い始め抗Mに対応して、細菌の増殖をモニタリングらい菌の生存率、 らい菌薬、およびマイコバクテリア株の2,4の成長と維持に。
動物モデルは、倫理的な問題、メンテナンスのコスト、動物の維持のために必要な特別なインフラ、結果の再現性が悪いと最終利回りを含め、特にアルマジロとヒト以外の霊長類では、いくつかの制限があります。現在、マウスはハンセン病研究のための好ましいモデル動物である。マウスを用いた実験室条件は、実施が容易で、容易に入手可能であり、標準化されたプロトコルを可能<sup> 7,8,9。ヌードマウスは、M.の維持に使用されている低くても実行可能な細菌性負荷で、T細胞欠損免疫応答があふれんばかりの肉芽腫形成と良好な細菌性の乗算につながるためらい菌菌株 。このように、この動物モデルは、ハンセン病研究コミュニティ内で広く受け入れを得ています。
今回の報告では、我々はヌードマウスのフットパッドからの菌の酵素を精製するための単純なプロトコルを記述し、Mの準備のために意図最小限の細胞破片と、高細菌の生存率とのらい菌サスペンション。生存率は急速に実験室で行うことができ、蛍光顕微鏡法によって決定される。また、コールドチールネルゼン染色および光学顕微鏡により桿菌カウントするための標準的な方法への変更を示しています。さらに、我々はMのメンテナンスや保管のための代替プロトコルを提示細菌性STの凍結融解を可能らい菌の菌株、ocks。
Mの増殖のためのよく示され、成功したプロトコルの詳細な説明らい菌は大いに必要とされている。我々の研究は、ろ過およびトリプシン消化による接種の準備のプロトコルは接種材料は、(+スコア0)非常に少ない細胞片とし、菌の高い生存率を得ることができることを実証している。水酸化ナトリウムは、桿菌6の精製の ための組織を分解するために使用されている。 M.の精製の ために水酸化ナトリウムを用いて我々の研究室で行われた研究らい菌は生存判定および動物接種(データは示していない)のための懸濁液の均質化を妨げ、菌の塊の形成をもたらした。
ろ過およびトリプシン消化により接種の準備が直面する潜在的な問題は、細菌や真菌剤との接種物の細胞片と汚染を大量に含まれています。携帯DEBRの場合大量に精製後に観察されない、いずれかのトリプシンはもはやアクティブであるか、生物学的物質の過剰な量があるとされている。トリプシン原液の酵素活性を評価する必要があります。初期の生物学的材料の過剰が疑われる場合、材料は、アリコートに分割されるべきであり、プロトコルは、別々のバッチで実施されるべきである。細菌や真菌剤との接種物の汚染を避けるために、注意が無菌条件下で材料を処理するのに注意する必要があります。真菌および/または細菌汚染が検出された場合、懸濁液は廃棄されるべきである。
我々のプロトコルの制限が記載された半定量的な方法を使用して生存能力評価の主観性である。生存率は公表定量法6より精度が、より実用的で半定量的に評価した。 0 +と1 +の実行可能性のスコアが伝播し、凍結の維持のために満足のいくものであるらい菌。ラヒリら 。すでに百分の80から90までの実行可能な接種材料を接種したヌードマウスは、接種の4〜5ヶ月で(高い生存菌)を採取するのに適したフットパッドにつながることが示されている。したがって、(4ヶ月前後)感染初期には最高の収穫期である。凍結接種の収穫のために、本プロトコルにおけるマウスは成長曲線を保証するために、より長い期間(6ヶ月)、接種維持した。適切な実行可能性を確保するための重要なステップは、ホストからの生物学的物質の収集および処理した後、好ましくは、24時間以内に、新鮮な菌懸濁液を使用することである。また、試薬の品質、新たに調製した希釈トリプシンおよび生存能力染色ソリューションは、再現性のある結果を保証するために必要です。
このプロトコルの他の制限は、最終M.らい菌懸濁液は、宿主DNA、RNA、タンパク質等の自由ではない。したがって、他の精製工程はtは添加されなければならないO Mを得るらい菌サスペンション宿主細胞成分を含まない。
M.の全組織標本を凍結することによって、生存菌を維持するための方法らい菌病変は9報告されている。しかし、Portaels らの研究。凍結Mの解凍後65から97までパーセントの間の範囲の生存率を実証し大幅な損失、 らい菌はアルマジロ9から得られた組織標本を感染させた。我々のプロトコルは、生存能力指数はMに見られていることを実証( 表1)に凍結されていなかった分量と比較した場合、凍結融解後のらい菌懸濁液は、ドロップされた。実際、Mを凍結生存能力スコア0 +は凍結していないサスペンションにしている間生存率は、1 +のスコアを持つメディアを凍結におけるらい菌の懸濁液を50〜70%の範囲の生存率をもたらした。それにもかかわらず、Mの乗算らい菌は (ヌードマウスの7ヶ月後の接種後良好であった<strong>表1)。再構成サンプルでヌードマウスの接種は平均100回初期接種に比べて菌数が増加した60日間の凍結を維持。それが表示されるMを凍結代わりに、感染した組織標本の凍結培地中らい菌懸濁液を、より効率的である。我々のプロトコルの重要なステップは、コルストンとヒルソン8によって示されるように、実行可能な菌を維持するために必要な冷凍コンテナ、中AFBの緩慢凍結である。将来の実験は、より長い期間の後に凍結菌の生存率を評価するために実施されるであろう。
要約すると、M.理由らい菌はin vitroで成長しない、我々のプロトコルは、実行可能な接種物の維持管理のための迅速かつ容易な代替を可能にし、成功した冷凍工程は、このように定義された株の銀行の設立を可能にする、動物での連続継代することなく、株の維持を可能にする。
このセクションでは、このプロトコルを実行するための試薬を調製するための手順を説明します。
1。トリプシン
トリプシン | 0.5グラム |
蒸留水 | 100ミリリットルまで |
殺菌フィルター。 -20℃で保存
2。 7H9
7H9ブロスベース | 4.7グラム |
40%のグリセロールストック | 5ミリリットル |
蒸留水 | 900ミリリットルまで |
撹拌しながら、グリセリンを追加した後、水でベースを混ぜる。滅菌する20分間121℃でオートクレーブ。 4℃で保存する
3。ブレインハートインフュージョン(BHI)
BHI | 37グラム |
蒸留水 | 最大千ミリリットル |
滅菌する15分間121℃でオートクレーブ。 4℃で保存する
4。フェノール血清
4.1)、5%フェノール
フェノール | 5ミリリットル |
蒸留水 | 100ミリリットルまで |
4.2)は、血清フェノール
ウシ胎仔血清 | 2ミリリットル |
5%フェノール | 98ミリリットル |
4℃で保存する
5。冷たいチールネルゼンステインのためのソリューション
5.1)CarboFuchsin
フクシン | 1グラム |
フェノール結晶を60℃に融合 | 5ミリリットル |
純粋なエチルアルコール | 10ミリリットル |
蒸留水 | 100ミリリットルまで |
各使用前にフィルタ。
5.2)メチレンブルーベース
メチレンブルー | 3グラム |
95%エチルアルコール | 200ミリリットルまで |
5.3)アルコール酸
70%アルコール | 990ミリリットル |
chloridric酸 | 10ミリリットル |
6。凍結用培地:
OADC | 10ミリリットル |
グリセロール | 20ミリリットル |
7H9培地 | 100ミリリットルまで |
使用前にオートクレーブグリセロール、濾過によりOADCを殺菌。
7。オートクレーブ処理M.らい菌サスペンション
20分間121℃でオートクレーブ。 -20℃で保存
The authors have nothing to disclose.
我々は技術支援のためのベアトリス·GCサルトーリ、LázaraM.トリノ、アナエリサフサロとクラウディア午後カルバリョに感謝します。私たちは、動物施設の設立を支援するためのプラナーブムK.ダスに感謝します。私たちは、原稿を改訂するためにLAIS RRコスタに感謝します。この研究は、デ·アンパロàPesquisaはトルカ·デ·サンパウロ(FAPESP 2009/06122-5)を行いFundaçãoパウリスタコントラHanseníaseとFundaçãoからの補助金によってサポートされていました。
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo1°C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova INC | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer – 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |