Здесь мы опишем общий метод случайной microseed матрицы скрининга. Этот метод показан значительно увеличить шансы на успех белковых кристаллизации скрининга экспериментов, снизить потребность в оптимизации, а также обеспечить надежную поставку кристаллов для сбора данных и лиганд-купания экспериментов.
Случайное скрининг microseed матрица (РММС) представляет собой метод кристаллизации белка, в котором затравочные кристаллы добавлен в случайных экранов. Увеличивая вероятность того, что кристаллы будут расти в метастабильной зоны фазовой диаграммы белка, дополнительные провода кристаллизации часто получают, качество кристаллов, произведенных может быть увеличена, и хороший запас кристаллов для сбора данных и купания экспериментов обеспечивается. Здесь мы опишем общий метод РММС, которые могут быть применены к либо сидя падение или висит диффузии экспериментов пара падение, установленных вручную или с использованием жидких робототехнику обработки, в 96-колодца или формате 24-а в трее.
С момента своего первоначального заявления Перутца, Кендрю с сотрудниками в определении структуры гемоглобина и миоглобина, к современным высокой пропускной автоматизированных трубопроводов структурной геномики консорциумов, макромолекулярный рентгеновской кристаллографии предоставил нам беспрецедентную структурную заглянуть в мире белка . Этот метод остается наиболее широко применяется экспериментальный метод, который позволяет прямой визуализации структуры белка в атомной, или около атомным разрешением (т.е. в диапазоне 1-3 Å). Предпосылкой для рентгеновской дифракции, которая будет применяться к белку в том, что оно должно быть сначала кристаллизуется, и именно это этап процесса, который остается самым крупным ограничение скорости шаг в определении структуры дифракционными методами 1, 2. Несмотря на значительные успехи в понимании процесса кристаллизации белков, и значительные улучшения в качестве и доступности экранов кристаллизации,лотки, и связанные с ними технологии, остается невозможным достоверно предсказать вероятность успеха кристаллизации 3. Биохимические и биофизические методы могут быть применены для оценки того белок процентных дисплеев благоприятные характеристики для зарождения кристаллов и роста, то есть это хорошо сложенный, однородная, монодисперсными и т.д., однако, эти знания ни в коей мере обеспечить окончательный предиктором кристаллизации склонность.
Посев уже давно якобы быть жизнеспособным способ улучшения количество, размер и качество существующих кристаллов или кристаллического материала 4-7. Этот подход основан на том, что состояние, которое поддерживает зарождения кристаллов не может быть оптимальным для последующего роста кристаллов и наоборот. Передавая ядросодержащие материал из одного состояния в другое, можно попытаться эффективно отделить эти процессы, тем самым, предоставляя доступ к новым, еще неизведанные пространства кристаллизации,и в результате увеличения общего показателя успешности скрининга эксперимента. Штатные методы были зарегистрированы для (I) macroseeding, передача монокристалла во всей его полноте из одного состояния в другое 8, (II) полоска посева, передача зародышевого материала, как правило, полученной путем применения направленного давления с использованием, например усов у кошки на поверхность существующей кристалла, а затем последующего прохождения минимальным через новый падения кристаллизации 9, и (III) "классической" microseeding, передача Кристалл "семян", порожденных уборки раздавил кристаллы (или кристаллический материал), в условиях, сходных с теми, которые дали семенам 10. Примечательно все три из этих методов требуют много времени и плохо масштабируемым, конечно по сравнению с тем, что это достижимо с современными робототехники кристаллизации обработки жидкостей. Эти факторы способствовали, в какой-то степени, по крайней мере, в восприятии, что семяIng является методом для посещения только тогда, когда другие подходы не смогли приносить свои плоды.
Случайная матрица microseeding (РММС) Недавнее методологическая инновация, которая сочетает в себе преимущества традиционного microseeding с тех скрининга высокой пропускной и масштабируемости 11-13. Этот подход основан на генерации семенного материала, полученного из зародышевого кристаллического материала, который может быть аликвоты в / на каждой sub-well/coverslip в пределах стандартного экрана кристаллизации 96-условию. Этот метод применим к обоим сидя или висит пара падение диффузии эксперименты, установленные вручную или с использованием жидких робототехнику обработки, в 24-колодца или 96-луночного формата трее. РММС было продемонстрировано экспериментально значительно увеличить показатель успеха кристаллизации, и производят кристаллы повышения качества дифракции и количества 11, 13, 14, и представляет собой инновационный инструмент в арсенале кристаллографы "подходов в оNgoing усилия на пути к успеху кристаллизации. Здесь мы опишем общий метод РММС и обеспечить образцы данных, иллюстрирующих эффективность этого метода.
В этой статье мы описали общий метод РММС белка скрининга кристаллизации. Мы показали, используя два тестовых белков значительно усилены в успешности кристаллизации с помощью этого метода. Анализ дифракции с использованием синхротронного излучения подмножества кристаллов, полученн?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась частично BBSRC (BB/1006478/1). ПРР является получателем исследовательский грант Королевское общество университета.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
Crystal Phoenix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |