تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص
Summary
نحن هنا تصف طريقة عامة لفحص عشوائي microseed المصفوفة. ويظهر هذا الأسلوب إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح بلورة البروتين التجارب الفرز، وتقلل من الحاجة إلى التحسين، وتوفير إمدادات موثوقة من بلورات لجمع البيانات والتجارب يجند تمرغ.
Abstract
فحص عشوائي microseed مصفوفة (rMMS) هو أسلوب بلورة البروتين في البلورات التي تضاف إلى البذور شاشات عشوائي. عن طريق زيادة احتمال أن بلورات سوف تنمو في المنطقة متبدل الاستقرار من مرحلة رسم تخطيطي بروتين، وغالبا ما يتم الحصول عليها يؤدي تبلور اضافية، ويمكن زيادة جودة البلورات المنتجة، ويتم توفير امدادات جيدة من بلورات لتجارب جمع البيانات وتمرغ. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS التي يمكن تطبيقها إما الجلوس أو قطرة قطرة شنقا التجارب نشر بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 96 جيدا أو شكل علبة 24 أيضا.
Introduction
من التطبيق الأولي من خلال Perutz، Kendrew وزملاء العمل في تحديد هياكل الهيموجلوبين والميوجلوبين، إلى إنتاجية عالية خطوط الأنابيب الحديثة الآلي للاتحادات الجينوميات الهيكلي، والجزيئات البلورات بالأشعة السينية قد أتاحت لنا لمحة هيكلية غير مسبوقة في عالم البروتين . لا تزال هذه التقنية المنهج التجريبي الأكثر انطباقا على نطاق واسع أن يسمح للرؤية مباشرة من بنية البروتين في الذرية، أو بالقرب القرار الذري (أي في حدود 1-3). ومن الشروط الأساسية لحيود الأشعة السينية ليتم تطبيقها على البروتين هو أنه يجب أولا أن تبلور، وهذا هو مرحلة من مراحل العملية التي لا تزال أعظم خطوة الحد من معدل واحد في تحديد هيكل بالطرق الحيود 1 و 2. على الرغم من التقدم الكبير في فهمنا لعملية بلورة البروتين، وتحسينات كبيرة في نوعية وتوافر شاشات التبلور،الصواني، والتكنولوجيات ذات الصلة، فإنه لا يزال من المستحيل التنبؤ بشكل موثوق من احتمال نجاح تبلور 3. ويمكن تطبيق أساليب الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية لتقييم ما إذا كان البروتين من الفائدة يعرض خصائص مواتية لالتنوي الكريستال والنمو، أي هو مطوية جيدا، متجانسة، monodisperse، وما إلى ذلك، ولكن هذه الأفكار في أي وسيلة توفر مؤشرا نهائيا التبلور الميل.
منذ فترة طويلة البذر يزعم أن يكون وسيلة ناجعة لتحسين عدد وحجم ونوعية بلورات القائمة أو المواد البلورية 4-7. ويستند هذا النهج على أساس أن شرط أن يدعم الكريستال التنوي قد لا تكون الأمثل لنمو البلورات اللاحقة والعكس بالعكس. عن طريق نقل المواد الأنوية من حالة إلى أخرى، يمكن للمرء أن محاولة فصل هذه العمليات بشكل فعال، وبالتالي إعطاء الوصول إلى الجديد، كما تبلور الفضاء غير مستكشفة بعد،ونتيجة لزيادة معدل النجاح العام من تجربة الفرز. وقد تم توثيق طرق أنشئت ل(ط) macroseeding، ونقل من بلورة واحدة في مجملها من شرط واحد إلى 8 آخر، (ب) بذر متتالية، ونقل المواد الأنوية، التي تم الحصول عليها بشكل عام من تطبيق الضغط باستخدام الاتجاه على سبيل المثال الخط الطولي القط على سطح بلورة القائمة، تليها مرور لاحقة من الخط الطولي من خلال انخفاض تبلور الجديدة 9، و (ج) "الكلاسيكية" microseeding، ونقل الكريستال "بذور"، التي تم إنشاؤها بواسطة الحصاد سحق بلورات (أو البلورية المواد)، في ظروف مماثلة لتلك التي أسفرت عن بذور 10. وخاصة كل ثلاثة من هذه الأساليب هي مضيعة للوقت وسوء تحجيم، وبالتأكيد بالمقارنة مع ما يمكن تحقيقه مع الحديث مناولة السائل الروبوتات التبلور. وقد ساهمت هذه العوامل، على مستوى بعض على الأقل، إلى الاعتقاد بأن البذورجي هو طريقة في أن يزوره فقط عندما فشلت المقاربات الأخرى لتؤتي ثمارها.
مصفوفة عشوائية microseeding (rMMS) هو الابتكار المنهجي الأخيرة الذي يجمع بين فوائد microseeding التقليدية مع تلك الفحص إنتاجية عالية وقابلية 11-13. يعتمد هذا النهج على توليد مخزون البذور، والمنتجة من المواد البلورية الأنوية، والتي يمكن aliquoted في / على كل sub-well/coverslip ضمن معيار 96-screen حالة التبلور. هذا الأسلوب ينطبق على كل من يجلس أو شنقا التجارب نشر انخفاض بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 24 جيدا أو شكل علبة 96 جيدا. وقد ثبت بالتجربة rMMS إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح التبلور، وإنتاج بلورات من قدر أكبر من الجودة والكمية حيود 11، 13، 14، ويمثل أداة مبتكرة في ترسانة البلورات 'النهج في سngoing الجهد نحو النجاح التبلور. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS وتوفير بيانات عينة توضح فعالية هذه التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة التي وصفناها طريقة عامة لrMMS بلورة البروتين الفرز. لقد أثبتنا باستخدام اثنين من البروتينات اختبار بزيادة كبيرة في معدل نجاح تبلور باستخدام هذا الأسلوب. تحليل حيود باستخدام الإشعاع السنكروتروني من مجموعة فرعية من بلورات إنشاؤها باستخدام rMMS وأساليب غير r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من BBSRC (BB/1006478/1). PRR هو المستفيد من زمالة أبحاث جامعة الجمعية الملكية.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Phoenix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , (2009).
- Rupp, B. . Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T. Seeds to crystals. J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D’Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
