Hier beschrijven we een algemene methode voor willekeurige microseed matrix screening. Deze techniek is een significante toename van de slaagkans van eiwitkristallisatie screeningsexperimenten, de behoefte aan optimalisatie en een betrouwbare aanvoer van kristallen voor gegevensverzameling en ligand-inweken experimenten.
Random microseed matrix screening (RMM) is een proteïne kristallisatie techniek waarbij zaad kristallen worden toegevoegd aan willekeurige schermen. Door het verhogen van de kans dat kristallen groeien in de metastabiele zone van een proteïne fasediagram, worden extra kristallisatie leidt vaak verkregen, de kwaliteit van de geproduceerde kristallen worden verhoogd, en een goede kristaltoevoer voor gegevensverzameling en weken experimenten voorzien. Hier beschrijven we een algemene werkwijze voor RMM die kunnen worden toegepast op zowel zittende druppel of opknoping druppel dampdiffusie experimenten, met de hand of met vloeistofverwerking robotica, in 96-well of 24-wells formaat opgesteld.
Vanaf de eerste toepassing ervan door Perutz, Kendrew en collega's bij het bepalen van de structuur van hemoglobine en myoglobine, aan de moderne high throughput geautomatiseerde pijpleidingen van de structurele genomics consortia heeft macromoleculaire X-ray kristallografie ons bood een ongekende structurele kijkje in het eiwit wereld . Deze techniek blijft de meest toepasselijke experimentele methode die de directe visualisatie van eiwitstructuur toelaat op atomaire, of in de buurt van atomaire resolutie (dwz in de 1-3 een Range). Voorwaarde voor röntgendiffractie worden toegepast op een eiwit dat eerst moet worden gekristalliseerd, en het is deze fase van het proces dat zich de grootste snelheidsbeperkende stap in structuurbepaling door diffractiemethodes 1, 2 blijft. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van het proces van proteïne kristallisatie, en belangrijke verbeteringen in de kwaliteit en beschikbaarheid van kristallisatie-schermen,laden en aanverwante technologieën blijft het onmogelijk om de kans op succes kristallisatie 3 betrouwbaar voorspellen. Biochemische en biofysische methoden kunnen worden toegepast om te beoordelen of een eiwit van interesse displays gunstige eigenschappen voor kristalkernvorming en groei, dus is het goed gevouwen, homogene, monodispers, enz., maar deze inzichten op geen enkele manier zorgen voor een definitieve voorspeller van kristallisatie geneigdheid.
Kiemen lang beweerd een haalbare werkwijze voor het verbeteren van het aantal, de grootte en kwaliteit van de bestaande kristallen of kristallijn materiaal 4-7 zijn. Deze benadering is gebaseerd op het uitgangspunt dat een voorwaarde dat nucleatie ondersteunt niet optimaal voor verdere kristalgroei en vice versa kunnen worden. Door de overdracht van een kern materiaal van de ene toestand naar de andere, kan men proberen om effectief te ontkoppelen deze processen, waardoor de toegang tot nieuwe, nog onontgonnen kristallisatie ruimte,en als gevolg een verbetering van de slaagkans van een screening experiment. Gevestigde methoden zijn beschreven voor (i) macroseeding, de overdracht van een enkel kristal in zijn geheel aan een toestand naar de andere 8, (ii) strook zaaien, de overdracht van kernen materiaal, algemeen verkregen door toepassing van gerichte druk met bijvoorbeeld een kat snorhaar op het oppervlak van een bestaande kristal, gevolgd door achtereenvolgende passage van de snorhaar door een nieuwe kristallisatie druppel 9, en (iii) "klassieke" microseeding, de overdracht van kristal "zaden", gegenereerd door oogsten gemalen kristallen (of kristallijn materiaal), in soortgelijke omstandigheden dat de zaden 10 opgeleverd. Met name alle drie van deze methoden zijn tijdrovend en slecht schaalbaar, zeker in vergelijking met wat haalbaar moderne vloeistofverwerking kristallisatie robotica. Deze factoren hebben bijgedragen, op een bepaald niveau althans de perceptie dat zaading is een methode om alleen te bezoeken wanneer andere methoden hebben gefaald vruchten af te werpen.
Random matrix microseeding (RMM) is een recente methodologische innovatie die de voordelen van de traditionele microseeding met die van high throughput screening en schaalbaarheid 11-13 combineert. Deze aanpak berust op het genereren van een uitgangsmateriaal, uit kernhoudende kristallijn materiaal, dat kan worden verdeeld in / op elke sub-well/coverslip bij een standaard 96-toestand kristallisatie scherm. Deze methode is van toepassing op zowel zittend of opknoping druppel dampdiffusie experimenten, met de hand of met behulp van liquid handling robotica, in 24-well of 96-wells formaat vastgesteld. RMM is experimenteel aangetoond aanzienlijk te verhogen kristallisatie succes en produceren kristallen groter diffractie kwaliteit en kwantiteit 11, 13, 14, en vormt een innovatief hulpmiddel in het arsenaal van de kristallografen "benaderingen in de oNgoing streven naar kristallisatie succes. Hier beschrijven we een algemene werkwijze voor RMM en zorgen voorbeeldgegevens illustreert de effectiviteit van deze techniek.
In dit artikel hebben we een algemene methode voor RMM eiwitkristallisatie screening beschreven. We hebben aangetoond middels twee testeiwitten een significante verbetering in kristallisatie succes met deze methode. Diffractie analyse met behulp van synchrotronstraling uit een subset van kristallen gegenereerd met behulp RMM en niet-RMM methoden geopenbaard weinig variatie in kwaliteit tussen diffractie kristallen gegroeid bij procedure, vroegere auteurs rapporteerden dat goede kwaliteit kristallen vaker groeien in RMM …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd deels gefinancierd door de BBSRC (BB/1006478/1). PRR is de ontvanger van een Royal Society Universiteit Research Fellowship.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
Crystal Phoenix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |