Aqui nós descrevemos um protocolo para manipulação optogenetic de atividade motoneurônio enquanto monitora mudanças na saída do motor (contração muscular) em semi-intactas<em> Drosophila</em> Larvas usando laser dentro de um microscópio confocal convencional. Esta técnica permite aos investigadores perturbação atingir locais de actividade neural em poucos neuromeres para elucidar a dinâmica do circuito do motor.
Drosophila larval locomoção é um sistema modelo excelente no desenvolvimento fisiológico e neuroscience, em virtude da acessibilidade genética dos componentes neuronais subjacentes existentes nos circuitos 1-6. Aplicação de optogenetics 7,8 no circuito neural larval nos permite manipular a atividade neuronal de uma forma espacialmente e temporalmente estampados 9-13. Tipicamente, as amostras são largamente iluminada com uma lâmpada de mercúrio ou de LED, de modo a especificidade dos neurónios-alvo é controlado por sistemas de expressão de genes binários como o sistema Gal4 UAS-14,15. Neste trabalho, para melhorar a resolução espacial de "resolução sub-genético", que localmente iluminado um subconjunto de neurónios no cordão nervoso ventral utilizando lasers implementadas em um microscópio confocal convencional. Ao monitorizar o movimento da parede do corpo do semi-larva intactos, nós interactivamente activado ou inibido actividade neural com o 16,17 channelrodopsinar halorodopsina 18-20, respectivamente. Por espacialmente e temporalmente restrita iluminação do tecido neural, pode-se manipular a actividade dos neurónios específicos no circuito a uma fase específica do comportamento. Este método é útil para estudar a relação entre as actividades de um conjunto neural local no cordão nervoso ventral e o padrão de espaço-temporal de saída do motor.
Locomoção para a frente peristáltica em larvas de Drosophila ocorre pela propagação da contração muscular do posterior aos segmentos anteriores. Este movimento é realizado pela ativação seqüencial dos neurônios motores dentro do cordão nervoso ventral ao longo do eixo longitudinal do corpo. Para examinar o circuito por trás dessa atividade de propagação modelada, perturbação locais da atividade neural poderia ser uma abordagem informativa. Embora o ensaio farmacológico pode controlar substância específica, tais como neurotransmissores, no tecido neural, os efeitos farmacológicos das drogas podem ser semelhantes entre quase todos os segmentos porque o cordão nervoso ventral larval é a estrutura repetitiva composto neuromeres semelhantes ao longo do eixo longitudinal. Alternativamente, pode-se expressar optogenetic ou moléculas de sonda, sensíveis à temperatura, em um pequeno número de segmentos. No entanto, essas linhas Gal4 específicas são muito difíceis de produzir. Aqui é apresentado um método para manipulação de neurónios em alguns segmentos que utilizam iluminação a laser. Aproveitando-se da iluminação espacialmente confinado em microscopia confocal, pode perturbar a atividade dos neurônios em uma área local. Combinado com o padrão de expressão da sonda por subconjuntos de gal4 linhas específicas de neurônios, este método de iluminação a laser melhora muito a resolução espacial para a perturbação. E porque este método requer apenas um microscópio confocal convencional, a compra de equipamentos de laboratório adicional normalmente não é necessário.
Utilizando esta técnica, que examinaram o papel da actividade neuronal motora durante a propagação de saída do motor 13. Ao bloquear as actividades dos neurónios motores em poucos segmentos durante o movimento peristáltico, fomos capazes de testar se a actividade dos próprios neurónios motores é necessária para a propagação do sinal de saída do motor. Bloqueio local e transitória dos neurônios motores detido a propagação do movimento peristáltico. Após o bloqueio foi removida, própagation apareceu no segmento em que a onda tinha sido preso. Este fenômeno sugere que sem a ativação neuronal motora, a onda propagativo não pode progredir ao longo do cordão nervoso ventral mais longe, e, portanto, é necessário para o movimento peristáltico a ativação de neurônios motores. Nós relatamos anteriormente dados detalhados e discussões sobre este fenômeno em Inada et al. (2011) 13. Aqui, nós descrevemos o método para perturbar a actividade neural interactivamente durante a monitorização do movimento das larvas dissecados. Usando vários gal4 linhas e uma série de padrões espaço-temporais para a manipulação atividade, pode-se investigar a lógica de circuitos através das propriedades do circuito do motor de resposta de perturbação.
Perturbação temporal e local da atividade neural é uma técnica valiosa para analisar a dinâmica da rede de circuitos neurais. Neste protocolo, apresentamos um método para manipular a atividade neural por optogenetics usando um laser. Alta direcionalidade do laser permite estimulação optogenetic mais localizada do que a estimulação campo largo uso de mercúrio ou uma lâmpada Xenon. Embora iluminações de laser já foram aplicados para Optogenetics em estudos anteriores, configurações especiais, tais como a fibra de vidro, micromanipulador, e uma fonte de laser, são necessários na maioria dos estudos anteriores. Neste protocolo, usamos um microscópio confocal convencional para a iluminação local. Uma vez que o sistema de microscópio confocal é amplamente utilizada, este método vai abrir a possibilidade de aplicar Optogenetics de alta resolução em muitos laboratórios.
O protocolo tem dois pontos críticos: dissecção larval e potência do laser. Em primeiro lugar, se o cérebro, o cordão nervoso ventral ou um nervo motor é danificado during dissecção, as larvas apresentam menos ou nenhum movimento peristáltico espontânea. A precisão é, portanto, essencial, especialmente quando se fazer uma incisão no lado dorsal, com uma tesoura de mola e remoção de órgãos internos com uma pinça. Detalhes sobre a dissecação foram relatados anteriormente 21. Em segundo lugar, se a estimulação é suficiente para atingir, a potência do laser de cerca de 0,1 ~ 1 mW / mm 2 para ChR2 ou 1 ~ 10 mW / mm 2 para PNDH é necessária. Avaliou-se a potência do laser, como total de energia de luz abaixo de uma lente objectiva dividida por uma área estimada de iluminação. Medimos a potência total da luz usando um medidor de energia (mobiken, Sanwa MI Technos, Japão). Estimou-se a área de iluminação como constante vezes circular o quadrado do comprimento de onda do laser, o que dá mais ou menos área iluminada no limite de difração. Poder iluminação eficaz na amostra pode ser ajustada não só pela potência da saída do laser, mas também pela alteração da velocidade de digitalização e dormenteser de repetições. Nós digitalizados laser com 20-100 ms / pixel para 63 vezes. Além disso, o nível de proteína Optogenetics e a quantidade de ATR expressão também são críticos para a eficiência da estimulação. Assim, se as larvas não mostrou nenhuma resposta optogenetic, os seguintes pontos devem ser verificados e corrigidos: 1) potência do laser (por meio da otimização do sistema de microscópio), 2) nível de expressão da proteína optogenetics (marcando genótipo e temperatura criação), e 3) a quantidade de ATR (ajustando a concentração de ATR e período de alimentação). PNDH exige maior concentração de ATR que ChR2 faz por razões desconhecidas 13. ChR2 funciona bem em larvas criadas em alimentos contendo ATR menor (por exemplo, 0,1 mM) do que o descrito aqui (a 1 mM). Como a alimentação das larvas de 1 mM ATR é suficiente para fazer ChR2 foto-reativo, recomendamos esta concentração para o primeiro julgamento em ChR2 experimentos. A concentração de ATR pode subsequentemente ser titulada para baixo a partir de 1 mM. Quanto à duração da exposição por ATR, recomendamosa duração descrita aqui para robusto controle optogenetic. Nós muitas vezes não respeitou resposta optogenetic quando se alimentam de larvas de ATR por menor duração.
Neste protocolo, iluminação a laser e de aquisição de imagem são operados por um computador separado. Assim, a detecção clara do padrão espaço-temporal da iluminação laser, câmera CCD é fundamental para a análise de dados. Se o ponto de laser ou a linha é fraca imagem CCD, você deve otimizar o poder de lâmpada halógena e valor de ganho da câmera CCD para visualizar a iluminação a laser, mantendo parede do corpo visível.
Iluminação espacial e temporal mostrada neste protocolo fornece informações sobre circuitos motores larvais, no entanto, o método tem algumas limitações. Quanto ao aspecto "espacial", a localização da iluminação é registrado baixa de imagem CCD de ampliação usada para filmar os movimentos da parede do corpo por. Assim, a área de iluminação pode ser atribuído ao nível do segmento, mas não em nível celular. Como para o "temporal "aspecto, intervalo de tempo entre a ligação na analise por microscopia confocal a laser e de iluminação pelo laser depende do sistema de microscópio confocal e condição de digitalização. Consequentemente, alguns ensaios por tentativa e erro, é necessário para ajustar o tempo de iluminação. Desde que a temporização de iluminação pode ser determinado em filmes de imagem CCD, utilizando software adequado como ImageJ, o fator crítico na resolução temporal é a taxa de quadros de câmera CCD de imagem. Nós normalmente definir a taxa de quadros para 7,5-15 quadros por segundo.
Avanços em ferramentas optogenetic nos proporcionar uma oportunidade para modificar esse protocolo. Usamos 3 ª larvas possuindo OK6-Gal4 e UAS-ChR2 [H134R] ou UAS-NpHR2. Outras ferramentas optogenetic em vez de ChR2 [H134R] ou NpHR2 como ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 ou Arch pode aumentar a eficiência do controle da atividade 22. Além disso, utilizando outros gal4 linhas ou análise em outros estágios de desenvolvimento pode fornecer mais informações sobre o circui do motorts.
Neste protocolo, actividade motora foi monitorizada por meio de imagens de transmissão da contracção bodywall com uma câmara CCD. A atividade dos neurônios motores com moléculas de fluorescência de cálcio sensíveis (por exemplo, GCaMP) também pode ser diretamente monitoradas ao manipular a atividade neural com ChR2 ou PNDH. Neste caso, a iluminação a luz azul em uma área ampla e uma câmara CCD altamente sensíveis (por exemplo, câmara EMCCD) são usados em vez de uma lâmpada de halogénio e a câmara CCD normal, aqui descrito anteriormente. Para melhorar a resolução espacial de estimulação durante o monitoramento movimento bodywall, usando uma lente objetiva adicional pode ser um método mais avançado: iluminação do cordão nervoso ventral por uma lente objetiva de grande aumento (por exemplo, 40x) por cima da amostra e monitoramento bodywall por baixo da lente de ampliação (por exemplo, 4x) abaixo da amostra. Este sistema de lente dupla pode permitir-nos para estimular o sistema nervoso em maior resolução espacial.
<p class="Jove_content"> O protocolo mostrado aqui pode ser aplicado a outros circuitos neurais, ferramentas optogenetic proporcionados podem ser expressos no sistema nervoso e preparação em que a luz suficiente podem ser entregues no tecido neural pode ser estabelecida.The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras "Mesoscópica neurocircuitry" (n º 22115002) e "Comprehensive Rede Ciência Cérebro" (No. 221S0003), do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência, e Tecnologia, Japão para AN e Grant-in-Aid para Jovens Cientistas (B) (N º 21700344) do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência (JSPS) para HK
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |