نحن هنا وصف بروتوكول للoptogenetic التلاعب النشاط motoneuronal في حين رصد التغيرات في الناتج المحرك (تقلص العضلات) في شبه سليمة<em> ذبابة الفاكهة</em> اليرقات باستخدام الليزر في المجهر متحد البؤر التقليدية. هذه التقنية تمكن الباحثون لتحقيق اضطراب المحلية من النشاط العصبي في عدد قليل من neuromeres لتوضيح ديناميات الدوائر الحركية.
ذبابة الفاكهة اليرقات تحرك هو نظام نموذج رائع في علم الأعصاب التنموية والفسيولوجية، بحكم سهولة الجينية لمكونات الخلايا العصبية الكامنة في الدوائر 1-6. تطبيق optogenetics 7،8 في الدائرة العصبية اليرقات يتيح لنا التعامل مع نشاط الخلايا العصبية في طرق منقوشة مكانيا وزمانيا 9-13. عادة، تضاء العينات على نطاق واسع مع مصباح الزئبق أو الصمام، ويتم التحكم في خصوصية جدا من الخلايا العصبية المستهدفة من قبل ثنائي نظم التعبير الجيني مثل نظام GAL4-UAS 14،15. في هذا العمل، لتحسين القرار المكانية إلى "قرار شبه الوراثية"، ونحن مضيئة محليا مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في الحبل البطني العصب باستخدام الليزر تنفيذها في المجهر متحد البؤر التقليدية. في حين رصد حركة جدار الجسم من اليرقات شبه سليمة، ونحن تفعيلها بشكل تفاعلي أو تثبيط النشاط العصبي مع channelrhodopsin 16،17 سR halorhodopsin 18-20، على التوالي. بواسطة مكانيا وزمانيا إضاءة محدودة من الأنسجة العصبية، يمكننا التلاعب في نشاط الخلايا العصبية المحددة في الدائرة في مرحلة معينة من السلوك. وهذه الطريقة مفيدة لدراسة العلاقة بين أنشطة جمعية العصبية المحلية في الحبل البطني العصب ونمط الزمانية المكانية من الناتج المحرك.
تحرك إلى الأمام تحوي في يرقات ذبابة الفاكهة يحدث من قبل انتشار تقلص العضلات من الخلفي لشرائح الأمامي. ويتحقق هذا الاقتراح من قبل التنشيط متسلسلة من الخلايا العصبية الحركية في الحبل البطني العصب على طول محور الجسم الطولي. لفحص الدوائر وراء هذا النشاط الإكثار منقوشة، يمكن أن اضطراب المحلية من النشاط العصبي يكون نهجا بالمعلومات. على الرغم من أن الفحص الدوائية يمكن السيطرة على مادة معينة، مثل الناقلات العصبية، في الأنسجة العصبية، ويمكن للتأثير المخدرات الدوائية تكون مشابهة بين القطاعات كلها تقريبا لأن اليرقات الحبل البطني العصب هو بنية متكررة تتألف من neuromeres مماثلة على طول المحور الطولي. بدلا من ذلك، يمكن للمرء التعبير عن optogenetic أو جزيئات التحقيق حساسة للحرارة في عدد قليل من القطاعات. ومع ذلك، مثل GAL4 خطوط محددة هي صعبة للغاية لتوليد. ونحن هنا نقدم وسيلة لمعالجة الخلايا العصبية في بضع ثوانىالإدلاء بالبيانات باستخدام إضاءة الليزر. الاستفادة من الإضاءة تقتصر مكانيا في الفحص المجهري متحد البؤر، يمكن للمرء أن التشويش على نشاط الخلايا العصبية في منطقة محلية. جنبا إلى جنب مع نمط التعبير من لجنة التحقيق من قبل مجموعات فرعية من الخلايا العصبية GAL4 خطوط محددة، وهذه الطريقة إضاءة الليزر يحسن إلى حد كبير القرار المكانية للاضطراب. ولأن هذا الأسلوب يتطلب سوى المجهر متحد البؤر التقليدية، وشراء المعدات المختبرية إضافية هو عادة ليس ضروريا.
باستخدام هذه التقنية، درسنا دور نشاط الخلايا العصبية الحركية خلال نشر الانتاج موتور 13. من خلال منع أنشطة الخلايا العصبية الحركية في غضون بضعة شرائح أثناء الحركة تحوي، كنا قادرين على اختبار ما إذا كان نشاط الخلايا العصبية الحركية أنفسهم مطلوب لنشر إشارة خرج المحرك. الحصار المحلية وعابرة من الخلايا العصبية الحركية القبض على انتشار الحركة تحوي. بعد أن تم رفع الحصار، بروظهرت pagation في هذا الجزء حيث أنه تم القبض على الموجة. وتشير هذه الظاهرة التي بدون محرك تنشيط الخلايا العصبية، وموجة توالدي لا يمكن أن تقدم على طول الحبل البطني العصب إلى أبعد من ذلك، وبالتالي تفعيل الخلايا العصبية الحركية ضروري لحركة تحوي. لقد ذكرت سابقا بيانات تفصيلية ومناقشات حول هذه الظاهرة في Inada وآخرون (2011) 13. هنا، نحن تصف طريقة التشويش على النشاط العصبي بشكل تفاعلي حين رصد حركة اليرقات تشريح. باستخدام مختلف GAL4 خطوط وسلسلة من أنماط الزمانية المكانية للتلاعب النشاط، يمكن للمرء أن التحقيق في منطق الدوائر من خلال خصائص استجابة اضطراب من الدائرة الحركية.
اضطراب الزمنية والمحلية من النشاط العصبي هو أسلوب لا تقدر بثمن لتحليل ديناميات شبكة من الدوائر العصبية. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة للتلاعب النشاط العصبي بواسطة optogenetics باستخدام الليزر. الاتجاهية العالية ليزر يسمح التحفيز optogenetic أكثر محلية من التحفيز حقل واسع باستخدام الزئبق أو مصباح زينون. على الرغم من إضاءات الليزر وقد تم بالفعل تطبيقها على optogenetics في الدراسات السابقة، ويلزم الاجهزة الخاصة مثل الألياف الزجاجية، مياداة مجهرية، ومصدر ليزر، في معظم الدراسات السابقة. في هذا البروتوكول، ونحن استخدام الفحص المجهري متحد البؤر التقليدية للإضاءة المحلية. منذ يتم استخدام نظام المجهر متحد البؤر على نطاق واسع، وهذا أسلوب فتح الفرصة لتطبيق optogenetics دقة أعلى في العديد من المختبرات.
بروتوكول اثنين من النقاط الحرجة: تشريح اليرقات وقوة الليزر. أولا، إذا كان الدماغ، والحبل البطني العصب أو الأعصاب الحركية تلف الدوريتشريح نانوغرام، فإن اليرقات تظهر أقل أو لا شيء الحركة تحوي عفوية. وبالتالي الدقة أمر ضروري، خاصة عند إجراء شق على الجانب الظهري مع مقص الربيع وإزالة الأعضاء الداخلية مع ملقط. وقد تم الإبلاغ عن تفاصيل حول تشريح سابقا 21. ثانيا، إذا التحفيز يكفي أن يتحقق، طاقة الليزر من حوالي 0.1 ~ 1 ميغاواط / مم 2 للChR2 أو 1 مطلوب ~ 10 ميغاواط / مم 2 للNpHR. قمنا بتقييم قوة الليزر على أساس إجمالي قوة الضوء أدناه عدسة الهدف مقسوما على مساحة تقدر ب إضاءة. قمنا بقياس إجمالي قوة الضوء باستخدام السلطة متر (mobiken، سانوا MI Technos، اليابان). قدرنا مجال الإضاءة لأوقات ثابتة دائري مربع من طول موجة الليزر، والذي يعطي ما يقرب من المنطقة المضاءة في الحد الحيود. قوة الإضاءة فعالة على عينة يمكن تعديل ليس فقط من قبل السلطة من انتاج الليزر، ولكن أيضا عن طريق تغيير سرعة المسح الضوئي وخدرإيه من التكرار. نحن فحص الليزر مع 20-100 μsec / بكسل ل 63 مرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مستوى التعبير عن optogenetics البروتين وكمية ATR بالغة الأهمية بالنسبة لكفاءة التحفيز أيضا. وبناء عليه، إذا أظهرت يرقات أي رد optogenetic، يجب فحص النقاط التالية وتصحيحها: 1) قوة الليزر (عن طريق تحسين نظام المجهر)، 2) مستوى التعبير عن optogenetics البروتين (عن طريق فحص الوراثي ودرجة الحرارة تربية)، و 3) كمية من ATR (عن طريق ضبط تركيز ATR وتغذية الفترة). يتطلب NpHR تركيز أعلى من ATR من ChR2 يفعل لأسباب غير معروفة 13. ChR2 يعمل بشكل جيد في يرقات المرباة في الأغذية التي تحتوي على أقل ATR (مثل 0.1 ملم) من وصفها هنا (1 ملم). كما تتغذى اليرقات إلى 1 ملي ATR يكفي لصنع ChR2 الصورة التفاعلي، ونحن نوصي هذا التركيز للمحاكمة لأول مرة في ChR2 التجارب. تركيز ATR يمكن بعد ذلك أن معاير أسفل من 1 ملم. كما أن مدة التعرض لATR، ونحن نوصيمدة صفها هنا من أجل السيطرة optogenetic قوية. ونحن غالبا ما فشلت في مراقبة استجابة optogenetic عند تغذية اليرقات إلى ATR لأقصر مدة.
في هذا البروتوكول، ويتم تشغيل إضاءة الليزر والحصول على الصور عن طريق جهاز كمبيوتر منفصلة. لذلك، كشف واضح لنمط الزمانية المكانية من إضاءة الليزر بواسطة كاميرا CCD أمر بالغ الأهمية لتحليل البيانات. إذا بقعة الليزر أو خط قاتمة على الصورة CCD، يجب تحسين قوة مصابيح الهالوجين، وقيمة الربح للكاميرا CCD لتصور إضاءة الليزر مع الحفاظ على جدار الجسم المرئي.
إضاءة الزمانية المكانية هو مبين في هذا البروتوكول يوفر معلومات عن الدوائر موتور اليرقات، إلا أن الأسلوب له بعض القيود. كما أن الجانب "المكانية"، والموقع من الإضاءة يتم تسجيلها من قبل منخفضة التكبير CCD الصورة المستخدمة للتصوير بالفيديو الحركات جدار الجسم. وفقا لذلك، يمكن تعيين منطقة الإضاءة في الجزء الرفيع المستوى، ولكن ليس على المستوى الخلوي. وفيما يتعلق "تيemporal "الجانب، تأخر الوقت بين التبديل على المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر من قبل والإضاءة بواسطة الليزر يعتمد على نظام المجهر متحد البؤر وحالة المسح، وبالتالي مطلوب بعض التجارب عن طريق التجربة والخطأ لضبط توقيت الإضاءة. منذ توقيت إضاءة يمكن يتحدد في الأفلام صورة CCD باستخدام البرمجيات المناسبة مثل يماغيج، وعاملا حاسما في القرار الزماني هو معدل الإطار من CCD كاميرا التصوير. نحن عادة تعيين معدل الإطار ل7،5 حتي 15 لقطة في الثانية.
التقدم في أدوات optogenetic توفر لنا فرصة لتعديل هذا البروتوكول. كنا 3 طريق يرقات العمر حيازة OK6-GAL4 وUAS-ChR2 [H134R] أو UAS-NpHR2. أدوات optogenetic أخرى بدلا من ChR2 [H134R] أو NpHR2 مثل ChR2 [T159C/E123T]، NpHR3 أو قوس يمكن أن تعزز كفاءة الرقابة على النشاط 22. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام GAL4 خطوط أخرى أو تحليل في مراحل النمو الأخرى تقديم مزيد من المعلومات حول محرك داءره TS.
في هذا البروتوكول، تم رصد النشاط الحركي من خلال الصور انتقال من الانكماش bodywall مع كاميرا CCD. ويمكن أيضا نشاط الخلايا العصبية الحركية مع جزيئات مضان الكالسيوم الحساسة (مثل GCaMP) يتم رصدها مباشرة في حين التلاعب النشاط العصبي مع ChR2 أو NpHR. في هذه الحالة، يتم استخدام إضاءة الضوء الأزرق في منطقة واسعة وكاميرا CCD حساسة للغاية (على سبيل المثال كاميرا EMCCD) بدلا من مصابيح الهالوجين، والكاميرا CCD طبيعي سابقا الموصوفة هنا. لتحسين القرار المكانية من التحفيز في حين رصد حركة bodywall، وذلك باستخدام عدسة الهدف إضافية قد تكون وسيلة أكثر تقدما: إضاءة من الحبل البطني العصب بواسطة عدسة الهدف التكبير عالية (على سبيل المثال 40X) من فوق العينة ورصد bodywall بواسطة عدسة التكبير منخفضة (على سبيل المثال 4X) أدناه العينة. هذا نظام عدسة مزدوجة قد تسمح لنا لتحفيز الجهاز العصبي في أعلى المكاني القرار.
<p class="jove_content"> بروتوكول المعروضة هنا يمكن تطبيقها على الدوائر العصبية الأخرى، وأدوات optogenetic المقدمة يمكن التعبير عنها في الجهاز العصبي ويمكن أن تنشأ في إعداد التي يمكن تسليمها في ضوء كاف في الأنسجة العصبية.The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من خلال منحة في والمعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكرة "جرحشاعثزرحشرتاد Neurocircuitry" (رقم 22115002)، و "شبكة علوم الدماغ الشامل" (رقم 221S0003) من وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم، والتكنولوجيا، اليابان إلى والمنح التي تقدم للمساعدة للعلماء الشباب (B) (رقم 21700344) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) إلى هونج كونج
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |