준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을 설명<em> 초파리</em> 기존의 공 초점 현미경 내에서 레이저를 사용하여 유충. 이 기술은 모터 회로의 역학을 설명하기 위해 몇 neuromeres의 신경 활동 지역의 섭동을 달성하기 위해 연구자 수 있습니다.
초파리 유충의 운동력이 1-6 회로의 기본 연결을 구성 요소의 유전 접근의 미덕에 의해 개발 및 생리적 신경 과학의 훌륭한 모델 시스템입니다. 애벌레 신경 회로의 optogenetics 7,8의 응용 프로그램은 우리가 공간적 패턴 방법 9-13에 신경 활동을 조작 할 수 있습니다. 일반적으로 표본을 광범위 수은 램프 조명 LED를하는 경우, 대상 뉴런 너무 특이성 등 GAL4-UAS 시스템 14,15 같은 이진 유전자 발현 시스템에 의해 제어됩니다. 이 작품에서 "하위 유전 해결 방법"에 대한 공간 분해능을 향상시키기 위해, 우리는 로컬로 기존의 공 초점 현미경에 구현 된 레이저를 사용하여 복부 신경 코드의 뉴런의 하위 집합을 조명. 반 그대로 유충의 몸을 벽의 움직임을 모니터링하면서, 우리는 대화 형으로 활성화 또는 channelrhodopsin 16,17 O와 신경 활동을 억제각각 R halorhodopsin 18-20. 신경 조직의 공간적 및 시간적으로 제한된 조명함으로써, 우리는 행동의 특정 단계에서 회로의 특정 뉴런의 활동을 조작 할 수 있습니다. 이 방법은 복부 신경 코드를 로컬 신경 조립 및 모터 출력의 시공간적 패턴의 활동 사이의 관계를 연구하는 데 유용합니다.
초파리 유충에서 앞으로 연동 운동은 전방 세그먼트 후방에서 근육 수축의 전파에 의해 발생합니다. 이 운동은 세로 몸 축을 따라 복부 신경 코드 내에서 모터 뉴런의 연속 활성화에 의해 실현됩니다. 이 패턴 전파 활동 뒤에 회로를 검사하려면, 신경 활동 지역의 섭동은 정보 접근 방법이 될 수 있습니다. 약물 분석은 신경 조직에서 신경 전달 물질과 같은 특정 물질을 제어 할 수 있지만 유충의 복부 신경 코드가 세로 축을 따라 유사한 neuromeres로 구성된 반복적 인 구조이므로, 약물 약물의 효과는 거의 모든 세그먼트 사이에서 유사 할 수 있습니다. 또한, 하나의 세그먼트 소수 optogenetic 또는 온도에 민감한 프로브 분자를 표현할 수 있습니다. 그러나, 특정 GAL4 라인을 생성하기가 매우 어렵습니다. 여기에서 우리는 몇 가지 세그먼트에서 뉴런을 조작하기위한 방법을 제시레이저 조명을 사용하여 사항. 공 초점 현미경 공간적으로 국한 조명의 장점 복용 한 지역에서 뉴런의 활동을 교란 할 수 있습니다. 뉴런 특정 GAL4 라인의 하위 집합으로 프로브의 발현 패턴과 결합,이 레이저 조명 방식은 크게 교란에 대한 공간 해상도를 향상시킵니다. 이 방법은 기존의 공 초점 현미경을 필요로하기 때문에, 추가 실험실 장비의 구입은 일반적으로 필요하지 않습니다.
이 기술을 사용하여, 우리는 모터 출력 13 전파하는 동안 모터 신경 세포 활동의 역할을 하였다. 연동 운동하는 동안 몇 가지 부분에서 모터 뉴런의 활동을 차단하여, 우리는 모터 신경 자체의 활동이 모터 출력 신호의 전파해야하는지 여부를 테스트 할 수 있었다. 모터 뉴런의 지역 및 과도 봉쇄 연동 운동의 전파를 체포. 봉쇄가 제거 된 후, 프로pagation는 파도가 체포되었다 세그먼트에 나타났다. 이 현상은 모터 신경 세포의 활성화없이 propagative 파가 더 복부 신경 코드를 따라 진행 할 수없는 제안, 따라서 모터 뉴런의 활성화는 연동 운동이 필요합니다. 우리는 이전이나 다 등. (2011) 13 자세한 데이터와이 현상에 대해 토론을보고했다. 여기, 우리는 해부 애벌레의 움직임을 모니터링하면서 대화식으로 신경 활동을 교란하는 방법을 설명합니다. 다양한 GAL4 라인과 활동 조작을위한 시공간 패턴의 시리즈를 사용, 하나는 모터 회로의 교란 응답 속성을 통해 회로 논리를 조사 할 수 있습니다.
신경 활동의 시간적, 지역 섭동은 신경 회로의 네트워크 역학 분석을위한 귀중한 기술이다. 이 프로토콜에서는, 우리는 레이저를 이용하여 optogenetics하여 신경 활동을 조작하는 방법을 제시한다. 레이저의 높은 방향성 수은 또는 크세논 램프를 사용하여 넓은 시야의 자극보다 더 지역화 optogenetic 자극 할 수 있습니다. 레이저 조명은 이미 이전의 연구에서 optogenetics에 적용되어 있지만, 같은 유리 섬유, micromanipulator에, 레이저 소스와 같은 특별한 설정은 대부분의 이전 연구에 필요합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 지역의 조명에 종래의 공 촛점 현미경을 사용합니다. 공 촛점 현미경 시스템이 널리 사용되기 때문에,이 방법은 많은 실험실에서보다 높은 해상도 optogenetics을 적용 할 수있는 기회가 열립니다.
유충의 해부 및 레이저 힘 : 프로토콜은 두 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 뇌, 복부 신경 코드 또는 운동 신경 운영 시간에만 손상을 입히는 경우NG 해부, 유충이 덜 전시 또는 없음 자연스러운 연동 운동합니다. 정밀 스프링 가위 등의 측면에 절개를 만들고 집게와 내부 장기를 제거 할 때 특히 필수적이다. 해부에 대한 자세한 정보는 이전에 21보고되었습니다. 둘째, 만약 충분한 자극에 대한 0.1의 레이저 파워 ~ ChR2 또는 1 NpHR을위한 ~ 10 mW의 / mm 2가 필요합니다 1 mW의 / mm 2 달성 할 수있다. 우리는 조명의 예상 면적으로 나눈 대물 렌즈 아래에 총 빛의 힘으로 레이저 파워를 평가했다. 우리는 파워 미터 (mobiken, 산와 MI 테크노스, 일본)를 사용하여 전체 광 전력을 측정했다. 우리는 원형 일정한 시간 약 회절 한계에 조명 영역을 제공하는 레이저의 파장의 제곱 조명의 영역을 추정 하였다. 샘플에 효과적인 조명 전력은 스캔 속도와 감각을 변경하여도 레이저 출력의 힘에 의해뿐만 아니라 조정 할 수 있지만,반복 어. 우리는 63 시간을위한 20 ~ 100 마이크로 초 / 픽셀로 레이저를 검색합니다. 또한, optogenetics 단백질과 ATR의 양의 발현 수준은 자극 효율성을 위해 중요하다. 레이저 파워 (현미경 시스템을 최적화하여), 2) optogenetics 단백질의 발현 수준 (유전자형과 양육 온도를 확인하여), 3) 금액은 1) : 유충이 더 optogenetic 반응을 보였다 없을 경우 따라서, 다음 사항을 점검하고 수정해야합니다 ATR (ATR의 농도를 조정하고 기간을 공급하여). NpHR 13 알 수없는 이유에 의하여 ChR2보다 ATR의 높은 농도를 필요로합니다. ChR2는 여기에 설명 된 것보다 낮은 ATR (예를 들어 0.1 MM) (1 ㎜)를 포함하는 음식을 사육 유충에서 잘 작동합니다. 1 ㎜의 ATR에 유충을 먹이는 ChR2 사진 반응을 만들기위한 충분로서, 우리는 ChR2 실험의 첫 번째 재판이 농도를 권장합니다. ATR의 농도는 이후 1 ㎜에서 아래로 적정 할 수 있습니다. ATR에 대한 노출 기간에 관해서는, 우리는 추천기간은 강력한 optogenetic 제어를 위해 여기에 설명. 우리는 종종 짧은 기간 동안 ATR에 유충을 먹이 때 optogenetic 반응을 관찰하는 데 실패했습니다.
이 프로토콜에서는, 레이저 조명 및 이미지 수집은 별도의 컴퓨터에 의해 운영됩니다. 그래서, CCD 카메라로 레이저 조명의 시공간적 패턴의 명확한 탐지 데이터 분석을위한 중요합니다. 레이저 반점이나 줄이 CCD 이미지의 희미한 경우, 할로겐 램프 및 신체 벽에 볼을 유지하면서 레이저 조명을 시각화하는 CCD 카메라의 게인 값의 파워를 최적화합니다.
이 프로토콜에서와 같이 시공간 조명 애벌레 모터 회로에 대한 정보를 제공하지만, 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 에 관해서는 "공간"부분, 조명의 위치는 몸을 벽의 움직임을 비디오 테이프에 사용되는 낮은 배율 CCD 이미지가 기록됩니다. 따라서, 조명 영역은 세포 수준에서 세그먼트 레벨에서 할당하지만 할 수 있습니다. "T에 관해서레이저로 공 초점 현미경 조명에 의해 레이저 스캔에 전환 사이 emporal "측면, 시간 지연은 공 촛점 현미경 시스템 및 스캔 상태에 따라 달라집니다. 따라서, 시행 착오에 의해 약간의 테스트가 조명 시간을 조절해야합니다. 조명의 타이밍이 할 수 있기 때문에, ImageJ에 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 CCD 이미지 영화에서 결정, 시간적 해상도에서 중요한 요소는 CCD 카메라 영상의 프레임 속도입니다. 우리는 일반적으로 초당 7.5-15 프레임에 대한 프레임 속도를 설정합니다.
optogenetic 도구의 발전은 우리에게이 프로토콜을 수정할 수있는 기회를 제공합니다. 우리는 제 3 령기 OK6-GAL4을 가진 애벌레와 UAS-ChR2 [H134R] 또는 UAS-NpHR2를 사용했습니다. 대신 ChR2의 다른 optogenetic 도구 [H134R] 또는 NpHR2 같은 ChR2로 [T159C/E123T] NpHR3 또는 아치 활동 제어 (22)의 효율을 높일 수 있습니다. 또한, 다른 GAL4 라인을 사용하거나 다른 발달 단계에서 분석하면 모터 circui에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다TS.
이 프로토콜에서는, 모터 활동은 CCD 카메라로 bodywall 수축의 전송 이미지에 의해 측정 하였다. ChR2 또는 NpHR과 신경 활동을 조작하면서 칼슘에 민감한 형광 분자 (예를 들면 GCaMP)와 모터 뉴런의 활동을 직접 모니터 할 수 있습니다. 이 경우, 광범위한 지역과 고감도 CCD 카메라 (예 : EMCCD 카메라)의 푸른 빛 조명은 할로겐 램프 대신에 사용하고 일반 CCD 카메라는 이전에 여기에 설명되어 있습니다. 낮은 배율 렌즈 샘플 및 모니터링 bodywall 위의 높은 배율의 대물 렌즈 (예를 들면 40 배)에 의해 복부 신경 코드의 조명 : 추가 대물 렌즈를 사용하여 모니터링 bodywall 운동은 더 진보 된 방법이 될 수 있지만 자극의 공간 분해능을 향상시키기 위해 (예 : 4 개) 샘플 아래에. 이 듀얼 렌즈 시스템은 우리가 높은 공간 해상도 신경계를 자극 할 수 있습니다.
<p class="jove_content"> 여기에 표시된 프로토콜이 다른 신경 회로에 적용 할 수 제공 optogenetic 도구는 신경계 표현할 수있는 충분한 빛이 신경 조직에 전달 될 수있는 준비를 설정할 수 있습니다.The authors have nothing to disclose.
본 연구는 혁신 분야에서 과학 연구 보조금에 의해 지원되었다 "중시 Neurocircuitry"(제 22115002) 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술부의 "포괄적 인 뇌 과학 네트워크"(제 221S0003) 기술에 일본과 그랜트 – 원조 일본 학술 진흥회의 젊은 과학자 (B) (제 21700344) (JSPS)로 HK
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |