JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014
doi:
10.3791/50490
, , ,
1Department of Pathology and Molecule Medicine,McMaster University

Summary

Kolonisatie van de muriene nasopharynx met Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende extractie van aanhangende of gerekruteerde cellen wordt beschreven. Deze techniek omvat het spoelen van de nasopharynx en het opvangen van de vloeistof door de nares en is aanpasbaar voor verschillende uitlezingen, waaronder differentiële celkwantificering en analyse van mRNA-expressie in situ.

Abstract

Nasofaryngeale kolonisatie door Streptococcus pneumoniae is een voorwaarde voor invasie in de longen of bloedbaan1. Dit organisme is in staat om het mucosale oppervlak van de nasopharynx te koloniseren, waar het kan verblijven, zich kan vermenigvuldigen en uiteindelijk gastheerverdediging kan overwinnen om andere weefsels van de gastheer binnen te dringen. Het vaststellen van een infectie in de normaal lagere luchtwegen resulteert in longontsteking. Als alternatief kunnen de bacteriën zich verspreiden in de bloedbaan die bacteriëmie veroorzaakt, wat gepaard gaat met hogesterftecijfers 2, of anders rechtstreeks leiden tot de ontwikkeling van pneumokokken meningitis. Het begrijpen van de kinetiek van en immuunresponsen op nasofaryngeale kolonisatie is een belangrijk aspect van S. pneumoniae-infectiemodellen.

Ons muismodel van intranasale kolonisatie is aangepast aan menselijke modellen3 en is gebruikt door meerdere onderzoeksgroepen in de studie van gastheer-pathogene reacties in de nasopharynx4-7. In het eerste deel van het model gebruiken we een klinisch isolaat van S. pneumoniae om een zelfbeperkende bacteriële kolonisatie vast te stellen die vergelijkbaar is met vervoergebeurtenissen bij menselijke volwassenen. De hierin beschreven procedure omvat de bereiding van een bacterieel entmateriaal, gevolgd door de vaststelling van een kolonisatiegebeurtenis door levering van het entmateriaal via een intranasale toedieningsweg. Ingezeten macrofagen zijn het overheersende celtype in de nasopharynx tijdens de steady state. Meestal zijn er weinig lymfocyten aanwezig in niet-geïnfecteerde muizen8, maar mucosale kolonisatie zal leiden tot laag- tot hoogwaardige ontsteking (afhankelijk van de virulentie van de bacteriële soort en stam) die zal resulteren in een immuunrespons en de daaropvolgende rekrutering van gastheerimmuuncellen. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd door een lavage van de tracheale inhoud door de nares, en gecorreleerd met de dichtheid van kolonisatiebacteriën om de kinetiek van de infectie beter te begrijpen.

Protocol

Voordat u begint: alle stappen worden uitgevoerd in een Biohazard Level 2 (BSL2) Biological Safety Cabinet (BSC), tenzij anders vermeld. Zorg ervoor dat u de juiste Biohazard-goedkeuring hebt verkregen voor het gebruik van infectieuze bacteriële pathogenen volgens de institutionele richtlijnen voorafgaand aan de start van de experimenten. Zorg er bovendien voor dat u over alle materialen en reagentia beschikt die nodig zijn om de procedure vooraf uit te voeren. Muizen die in deze experimenten werden geb…

Representative Results

Figuur 1 geeft een overzichtsschema weer met een samenvatting van de belangrijkste stappen van het protocol. De figuren 2-3 geven een visualisatie van de microbiologische methodologie die inherent is aan de hierin beschreven protocollen. Figuur 4 staat voor een juiste positionering van een muis om een intranasale kolonisatie uit te voeren, terwijl figuur 5 typisch veranderingen in gewicht weergeeft van muizen gekoloniseerd met S. pneumoniae stam…

Discussion

In deze studie presenteerden we gedetailleerde methoden voor de intranasale kolonisatie van muizen met behulp van een klinische isolaatstam van Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende isolatie en karakterisering van de immuuncellen die als reactie op de bacteriën worden gerekruteerd voor nasopharynx. We hebben aangetoond hoe een bacterieel entmateriaal kan worden gekweekt in voedingsrijke media en kan worden gebruikt om een kolonisatiegebeurtenis bij muizen vast te stellen, die aanvankelijk beperkt is tot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Dr. Jeffery Weiser van de Universiteit van Pennsylvania bedanken voor zijn geschenk van de klinische stammen van Streptococcus pneumoniae. Dit werk werd gefinancierd door de Canadian Institutes for Health Research. CV werd gefinancierd door een M.G. DeGroote fellowship en een fellowship van de Canadian Thoracic Society. Dit werk werd gefinancierd door de Ontario Lung Association en Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Het werk in het Bowdish laboratorium wordt mede ondersteund door het Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research en het McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26G3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  3. McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
  4. Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
  5. van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
  6. Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
  7. Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
  8. McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
  9. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
  10. Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
  11. Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  12. Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
  13. Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  14. Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
  15. Wu, H. -. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  16. Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
  17. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
  18. Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
  19. Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
  20. Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
  21. Bryant, W. P., J, , et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I.. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  22. Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
  23. Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
  24. Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
  25. Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  26. Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
  27. Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
  28. Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
  29. Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
  30. Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
  31. Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
  32. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  33. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  34. Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
  35. Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
  36. Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
  37. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  38. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
  39. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).

Tags

Streptococcus PneumoniaeNasopharyngeal ColonizationIntranasalInflammatory ResponseImmune ResponseMouse ModelPneumoniaBacteremiaMeningitisResident MacrophagesLymphocytesBacterial Density

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image