Здесь мы опишем протокол для одновременного обнаружения модификации гистонов с помощью иммунофлуоресценции и ДНК-последовательностей ДНК FISH последующей 3D-микроскопии и анализа (3D иммуно-ДНК FISH).
Флуоресцентные на месте гибридизации с использованием ДНК-зондов на 3-размерной сохранились ядер следуют 3D конфокальной микроскопии (3D ДНК FISH) представляет собой наиболее прямой путь к себе расположение генов локусов, хромосомные суб-регионов или целых территорий в отдельных клетках. Этот тип анализа дает представление о глобальной архитектуре ядра, а также поведение конкретных локусов генома и регионов в ядерном пространстве. Иммунофлюоресценции, с другой стороны, позволяет обнаружения ядерных белков (гистонов изменения, гистонов варианты и модификаторы, транскрипция машин и факторов, ядерных суб-купе и т.д.). Основной проблемой в сочетании иммунофлюоресценции и 3D ДНК рыб, с одной стороны, сохранить эпитопа обнаружены антитела, а также 3D-архитектурой ядра, а с другой стороны, чтобы позволить проникновение ДНК-зонда для обнаружения генных локусов или хромосомных территорий 1-5. Здесь мы предлагаем протокол, который сочетает в себе визуализации хроматина модификации с геномных локусов в 3D сохранил ядер.
Эпигенетических спусковые механизмы создания и наследования развития и типа клеток конкретной транскрипционных профилей. На одном уровне это связано с модуляцией упаковки хроматина, который определяет активный или тихий регионов генома. В более широком масштабе, глобальной 3D организации генома и ядерных архитектуры также играть роль в контроле транскрипции моделей. Таким образом, рассечение этих эпигеномном функций имеет важное значение для полного понимания того, как гены регулируются 6-11.
Комбинированные иммунофлюоресценции и 3D ДНК FISH предоставляет уникальную возможность дополнить молекулярные и биохимические анализы по оценке специфических взаимодействий / ассоциации последовательностей ДНК и / или белков в ядре. Кроме того, в то время как по всему геному высокой пропускной методы, такие как иммунопреципитации хроматина (ChIP-далее) или хромосомы захвата конформации в сочетании с глубоким секвенирования (4C-след, 5C, Привет-C) обеспечивают глобальную DATна клеточных популяций 12, иммунофлюоресценции / ДНК FISH методы анализа позволяют на одном уровне клетки.
Здесь мы опишем протокол для одновременного обнаружения модификации гистонов с помощью иммунофлуоресценции и ДНК-последовательностей ДНК FISH последующей 3D-микроскопии и анализа (3D иммуно-FISH). Преимущество этого протокола является комбинированным визуализации ДНК и сохранению белковых структур. Наш опыт в этой области позволил нам усовершенствовать и упростить существующие протоколы. Хотя мы использовали этот протокол для обнаружения ДНК двухцепочечной перерывы в лимфоциты проходят рекомбинации, этот метод может быть применен к другим белков и других клеточных типов.
Описанные выше методы были использованы в нашей лаборатории для анализа регулирования V (D) J рекомбинации иммуноглобулинов и TCRA / д локусов в развивающихся лимфоциты 30,31. Мы уверены, что эта техника может быть адаптирована для обнаружения различных ядерных белков, ядерны…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить членов Скок лаборатории, особенно Сюзанна Хьюитт, для обсуждения и комментариев. Эта работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS является лейкемия и лимфома ученого общества. JC является членом Irvington Института исследований института рака. MM поддерживается Национального научного фонда грант интегративной последипломного образования и науки Стажировка (NSF IGERT 0333389).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
H2O | Fisher | # BP2470 | |
RNase A | Sigma | # R4642 | |
dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
DNase I | Roche | # 04536282001 | |
DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
Formamide | Fisher | # BP227 | |
Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
Slides | Fisher | # 12-550 | |
6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
Table 1. Specific reagents and small equipment. |