نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية DNA FISH).
الفلورسنت في الموقع التهجين باستخدام مجسات DNA على نواة-3 الأبعاد الحفاظ تليها المجهري متحد البؤر 3D (3D FISH DNA) يمثل الطريق الأكثر مباشرة لتصور موقع مواضع الجينات، الكروموسومات أو الأقاليم الفرعية في جميع الأراضي الخلايا الفردية. هذا النوع من التحليل يقدم نظرة ثاقبة في الهندسة المعمارية العالمية للنواة وكذلك سلوك مواضع الجينومية ومناطق محددة في غضون النووية. المناعي، من ناحية أخرى، يسمح الكشف عن البروتينات النووية (الهستونات تعديل، ومعدلات المتغيرات هيستون، آلات النسخ والعوامل، النووية شبه مقصورات، الخ). التحدي الرئيسي في الجمع بين المناعي و 3D FISH DNA هو، من ناحية الحفاظ على حاتمة الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة وكذلك الهندسة المعمارية 3D للنواة، وعلى الجانب الآخر، للسماح للتغلغل التحقيق للكشف عن الحمض النووي مواضع الجينات أو الكروموسومات الأراضي 1-5. هنا نقدم البروتوكول الذي يجمع بين التصور من التعديلات لونين مع مواضع الجيني في 3D النوى الحفاظ عليها.
إنشاء آليات جينية الزناد وراثة الخلية والتنموية محات من نوع النسخي محددة. في مستوى واحد وهذا ينطوي على تعديل لونين من التعبئة والتغليف التي تحدد المناطق الجينية النشطة أو الصمت. على نطاق أوسع، وتنظيم 3D العالمية للجينوم النووية والهندسة المعمارية أيضا أن تلعب دورا في السيطرة على أنماط النسخي. وهكذا، تشريح هذه الميزات epigenomic أمر ضروري لفهم كامل لكيفية الجينات وينظم 6-11.
الجمع بين FISH DNA المناعي و 3D فرصة فريدة لاستكمال التحليلات الجزيئية والكيمياء الحيوية عن طريق تقييم التفاعلات محددة / جمعيات تسلسل الحمض النووي و / أو البروتينات داخل النواة. وعلاوة على ذلك، في حين الجينوم على نطاق تقنيات إنتاجية عالية مثل مناعي لونين (رقاقة يليها) أو الكروموسوم التشكل القبض على جانب التسلسل العميق (4C-يليها، 5C، مرحبا C) تقديم دات العالميةوعلى السكان الخلية 12، تقنيات FISH المناعي / DNA يمكن من إجراء تحليلات على مستوى خلية واحدة.
نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية FISH). وميزة هذا البروتوكول هو التصور المشترك لDNA والحفاظ على هياكل البروتين. وقد مكن خبرتنا في هذا المجال لنا لتحسين وتبسيط البروتوكولات القائمة. على الرغم من أننا قد استخدمت هذا البروتوكول للكشف عن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل في الخلايا الليمفاوية التي تمر إعادة التركيب، يمكن تطبيق هذه الطريقة لغيرها من البروتينات وغيرها من أنواع الخلايا.
تم استخدام تقنيات المفصلة أعلاه في المختبر لتحليل تنظيم إعادة التركيب V J (D) من الغلوبولين المناعي ومواضع Tcra / د في تطوير الخلايا الليمفاوية 30،31. ونحن واثقون من أن يمكن تكييفها هذه التقنية للكشف عن البروتينات النووية المختلفة، مقصورات النووية ومواضع، ?…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر أعضاء المختبر Skok، وخاصة سوزانا هيويت، لإجراء مناقشات وتعليقات. ويدعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01GM086852، RC1CA145746 (JAS). JAS هو سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية عالم المجتمع. JC هو زميل معهد [إيرفينغتون] من معهد أبحاث السرطان. ويدعم MM من قبل الوطنية للعلوم منحة التعليم مؤسسة دراسات عليا التكاملية والبحوث التدريبية (NSF IGERT 0333389).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
H2O | Fisher | # BP2470 | |
RNase A | Sigma | # R4642 | |
dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
DNase I | Roche | # 04536282001 | |
DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
Formamide | Fisher | # BP227 | |
Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
Slides | Fisher | # 12-550 | |
6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
Table 1. Specific reagents and small equipment. |