Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-DNA FISH).
Ibridazione fluorescente in situ con l'utilizzo di sonde a DNA, il 3-dimensionale nuclei conservati seguito da 3D microscopia confocale (FISH DNA 3D) rappresenta il modo più diretto per visualizzare la posizione di loci genici, cromosomica sub-regioni o interi territori in celle singole. Questo tipo di analisi permette di comprendere meglio l'architettura globale del nucleo e il comportamento dei loci genomici e regioni nello spazio nucleare. Immunofluorescenza, invece, permette la rilevazione di proteine nucleari (istoni modificati, varianti istoniche e modificatori, macchinari e fattori di trascrizione nucleari, sotto-compartimenti, ecc). La sfida in combinazione FISH DNA immunofluorescenza e 3D è, da un lato di preservare l'epitopo riconosciuto dagli anticorpi così come l'architettura 3D del nucleo, e dall'altro, per consentire la penetrazione della sonda di DNA per rilevare loci genici o territori cromosomici 1-5. Qui forniamo un protocollo che combina la visualizzazione di modificazioni della cromatina con loci genomici in 3D nuclei conservato.
Epigenetica meccanismi di creazione di trigger e l'eredità di profili specifici di sviluppo e delle cellule di tipo trascrizionale. A un certo livello si tratta di modulazione degli imballaggi cromatina che definisce regioni genomiche attive o in silenzio. Su una scala più ampia, globale organizzazione 3D del genoma e architettura nucleare anche svolgere un ruolo nel controllo trascrizionale di modelli. Così, la dissezione di queste caratteristiche epigenomic è essenziale per una piena comprensione di come i geni sono regolati 6-11.
Combinato FISH DNA immunofluorescenza e 3D offrono una possibilità unica per integrare le analisi molecolari e biochimici valutando specifiche interazioni / associazioni di sequenze di DNA e / o proteine all'interno del nucleo. Inoltre, mentre il genoma tecniche ad alto rendimento, come immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) o la cattura conformazione cromosoma accoppiata con sequenziamento profondo (4C-seq, 5C, Hi-C) forniscono dat globaleuna su popolazioni cellulari 12, immunofluorescenza / DNA tecniche FISH affinché le analisi a livello di singola cellula.
Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-FISH). Il vantaggio di questo protocollo è la visualizzazione combinata di DNA e conservazione delle strutture proteiche. La nostra esperienza in questo campo ci ha consentito di migliorare e semplificare i protocolli esistenti. Anche se abbiamo usato questo protocollo per rilevare il DNA a doppio filamento rompe in linfociti sottoposti ricombinazione, questo metodo può essere applicato ad altre proteine e altri tipi di cella.
Le tecniche sopra descritte sono state usate nel nostro laboratorio per analizzare la regolazione di V (D) J ricombinazione delle immunoglobuline e TCRA / d loci nello sviluppo linfociti 30,31. Siamo certi che questa tecnica può essere adattata per il rilevamento di varie proteine nucleari, vani loci nucleari e, in diversi tipi di cellule-. Modifiche del protocollo può essere necessario, e in questo caso le fasi principali di concentrarsi su sono i seguenti. Primo, la lunghezza di pe…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Skok, soprattutto Susannah Hewitt, per le discussioni e commenti. Questo lavoro è supportato dal National Institute of sovvenzioni Salute R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS è un Leukemia & Lymphoma Society studioso. JC è un Fellow Irvington Istituto del Cancer Research Institute. MM è supportato da una formazione National Science Foundation Graduate Concessione Integrativa e tirocinio di ricerca (NSF IGERT 0333389).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
H2O | Fisher | # BP2470 | |
RNase A | Sigma | # R4642 | |
dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
DNase I | Roche | # 04536282001 | |
DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
Formamide | Fisher | # BP227 | |
Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
Slides | Fisher | # 12-550 | |
6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
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Table 1. Specific reagents and small equipment. |