Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.
Cromatina imunoprecipitação (CHIP) é um método amplamente utilizado para determinar as interações entre diferentes proteínas com o DNA na cromatina de células vivas. Exemplos incluem sequências específicas de DNA de ligação fatores de transcrição, histonas e seus diferentes estados de modificação, enzimas como RNA polimerases e fatores auxiliares e componentes de reparação do ADN. Apesar de sua onipresença, há uma falta de up-to-date, metodologias detalhadas para ambos banco preparação do material e para a análise precisa permitindo métricas quantitativas de interação. Devido a esta falta de informação, e também porque, como qualquer imunoprecipitação, as condições devem ser re-otimizado para novos conjuntos de condições experimentais, o ensaio chip é suscetível a resultados imprecisos ou mal quantitativa.
Nosso protocolo é em última análise, derivada do trabalho seminal no fator de transcrição: interações DNA 1,2, mas incorpora uma série de melhorias para sensibilizantesvidade e reprodutibilidade para os tipos de células de difícil obtenção. O protocolo foi utilizado com sucesso 3,4, ambos utilizando qPCR para quantificar o enriquecimento do ADN, ou uma variante usando semi-quantitativa do protocolo abaixo.
Esta análise quantitativa de material amplificado por PCR é realizada computacionalmente, e representa um factor limitante no ensaio. Controlos e outras considerações importantes incluem a utilização de um isotipo do anticorpo, bem como a avaliação de uma região do ADN genómico de controlo, tal como uma região intergénica não predito para ser ligado pela proteína sob estudo (ou antecipados não apresentam alterações ao abrigo as condições experimentais). Além disso, uma curva padrão de material de entrada para cada amostra de chip é usada para determinar os níveis absolutos de enriquecimento do material experimental. Uso de curvas padrão ajuda a levar em conta as diferenças entre conjuntos de primers, independentemente de como eles são projetados com cuidado, e também a eficiência diferemcias em toda a gama de concentrações de modelo para um único conjunto de primers. Nosso protocolo é diferente de outros que estão disponíveis 5-8 em que extensivamente cobrir a, fase posterior análise.
O protocolo acima fornece um método robusto de quantificar com precisão o enriquecimento do ADN a partir dos linfócitos primários usando chip. Uma das principais razões para a robustez deste protocolo é a inclusão da diversidade biológica repetições. O protocolo acima usa três repetições, o enriquecimento para os quais é calculado de forma independente. As saídas são então calculadas para fornecer um grau de enriquecimento e desvios padrão calculados para proporcionar uma medida de variabilidade. Para …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede CA141009 e GM39067. Agradecemos E. Parnell e R. Yarrington para comentários sobre a parte escrita.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Formaldehyde | Sigma | F-8775 | Store at RT |
Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30256.01 | Store at 4 °C |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 04693116001 | Store at 4 °C |
Protein G magnetic beads | Active Motif | 101945 | Store at 4 °C |
RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | Store at -20 °C |
Proteinase K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Store at -20 °C |
SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | Store at -20 °C |
1 M Glycine | Store at RT | ||
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | Store at 4 °C | ||
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | Store at RT | ||
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | Store at 4 °C | ||
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | Store at 4 °C | ||
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | Prepare fresh | ||
5 M NaCl | Store at RT | ||
0.5 M EDTA | Store at RT | ||
1 M Tris-HCl, pH 6.5 | Store at RT | ||
Table of Specific Reagents | |||
Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Model: 421105 | |
Magnetic Stand | Promega | Z5342 | |
Qiaquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Model: S3000 | |
UV Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
Heating Block | VWR | 13259-030 | |
Rotator | VWR | 80085-692 | |
Refrigerated bench top centrifuge | Beckman Coulter | Model: Allegra X-12R | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
Table of Equipment |