We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.
Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een veel gebruikte methode voor het bepalen van de interacties van verschillende eiwitten met DNA in chromatine van levende cellen. Voorbeelden zijn sequentie-specifieke DNA bindende transcriptiefactoren, histonen en hun verschillende wijzigingen staten, enzymen zoals RNA polymerasen en bijkomende factoren en DNA repair onderdelen. Ondanks de alomtegenwoordigheid, er is een gebrek aan up-to-date en gedetailleerde methoden voor zowel bank voorbereiding van materiaal en voor de nauwkeurige analyse toestaan kwantitatieve metrics van interactie. Door dit gebrek aan informatie en ook omdat, zoals elke immunoprecipitatie voorwaarden wordt opnieuw geoptimaliseerd voor nieuwe sets experimentele omstandigheden, de ChIP assay is gevoelig voor fouten of slecht kwantitatieve resultaten.
Ons protocol is uiteindelijk afgeleid van baanbrekende werk op transcriptiefactor: DNA interacties 1,2, maar bevat een aantal verbeteringen aan sensibilisatieviteit en reproduceerbaarheid voor moeilijk te verkrijgen celtypen. Het protocol is met succes gebruikt 3,4, beide met qPCR DNA verrijking kwantificeren, of met een semi-kwantitatieve variant van de volgende protocol.
Deze kwantitatieve analyse van PCR-geamplificeerde materiaal computationeel uitgevoerd en vormt een obstakel in het assay. Belangrijke controles en andere overwegingen omvatten het gebruik van een isotype-gematchte antilichaam en evaluatie van een controlegebied van genomisch DNA, zoals een intergene gebied niet voorspeld door het bestuderen eiwit (of verwacht te worden gebonden niet wijzigingen vertonen onder de experimentele omstandigheden). Daarnaast wordt een standaard curve van het uitgangsmateriaal voor elke chip monster van absolute niveau van verrijking leiden in het proefmateriaal. Gebruik van standaard curves helpt rekening met verschillen tussen de primer sets, ongeacht hoe goed ze zijn ontworpen, en ook verschillen efficiencyschillen hele reeks template concentraties voor een enkele primer set. Ons protocol is anders dan anderen die beschikbaar zijn 5-8 in dat we uitgebreid aan de latere, analysefase.
Het protocol biedt boven een robuuste methode nauwkeurig kwantificeren van DNA verrijking van primaire lymfocyten met chip. Een belangrijke reden robuustheid dit protocol is het opnemen van biologische repliceert. Het bovenstaande protocol gebruikt drie duplo, de verrijking waarvoor wordt onafhankelijk berekend. De uitgangen worden vervolgens gemiddeld om de verrijking en standaarddeviaties berekend dat een maat voor de variabiliteit te verstrekken. Voor elk monster drie technische replicaten worden ook uitgevoerd om de…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie CA141009 en GM39067. Wij danken E. Parnell en R. Yarrington voor commentaar op de schriftelijke gedeelte.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Formaldehyde | Sigma | F-8775 | Store at RT |
Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30256.01 | Store at 4 °C |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 04693116001 | Store at 4 °C |
Protein G magnetic beads | Active Motif | 101945 | Store at 4 °C |
RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | Store at -20 °C |
Proteinase K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Store at -20 °C |
SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | Store at -20 °C |
1 M Glycine | Store at RT | ||
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | Store at 4 °C | ||
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | Store at RT | ||
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | Store at 4 °C | ||
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | Store at 4 °C | ||
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | Prepare fresh | ||
5 M NaCl | Store at RT | ||
0.5 M EDTA | Store at RT | ||
1 M Tris-HCl, pH 6.5 | Store at RT | ||
Table of Specific Reagents | |||
Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Model: 421105 | |
Magnetic Stand | Promega | Z5342 | |
Qiaquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Model: S3000 | |
UV Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
Heating Block | VWR | 13259-030 | |
Rotator | VWR | 80085-692 | |
Refrigerated bench top centrifuge | Beckman Coulter | Model: Allegra X-12R | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
Table of Equipment |