Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.
Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Wechselwirkungen verschiedener Proteine mit DNA in Chromatin lebender Zellen. Beispiele umfassen sequenzspezifische DNA-bindende Transkriptionsfaktoren, Histone und ihre verschiedenen Modifikationen Zustände, Enzyme, wie RNA-Polymerasen und zugehörige Faktoren und DNA-Reparatur-Komponenten. Trotz seiner Allgegenwart, gibt es einen Mangel an up-to-date, detaillierte Methoden sowohl für Bank Vorbereitung des Materials und für die genaue Analyse ermöglicht quantitative Metriken der Interaktion. Durch diesen Mangel an Informationen, und auch, weil, wie jeder Immunpräzipitation Bedingungen müssen für neue Sätze von experimentellen Bedingungen neu optimiert werden kann, ist der Chip-Assay anfällig für fehlerhafte oder schlecht quantitative Ergebnisse.
Unser Protokoll wird schließlich vom bahnbrechenden Arbeiten auf Transkriptionsfaktor abgeleitet: DNA-Wechselwirkungen 1,2, sondern beinhaltet eine Reihe von Verbesserungen an Sensibilisierungvity und Reproduzierbarkeit für schwer zu erhalten Zelltypen. Das Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, 3,4, beide unter Verwendung von DNA-qPCR Bereicherung quantifizieren, oder mit Hilfe eines semi-quantitative Variante des unter Protokoll.
Diese quantitative Analyse der PCR-amplifizierten Materials rechnerisch durchgeführt und stellt einen begrenzenden Faktor in dem Assay. Wichtige Kontrollen und andere Überlegungen schließen die Verwendung eines Isotyp-Antikörper, sowie Auswertung einer Kontrolle Region von genomischer DNA, wie ein Zwischengenregion vorhergesagt nicht durch das Protein unter Studie (oder erwartet gebunden werden keine Änderungen unter zeigen die experimentellen Bedingungen). Darüber hinaus wird eine Standardkurve von Vormaterial für jeden Span Probe zur Ableitung absoluten Werte der Anreicherung im experimentellen Material. Verwendung von Standard-Kurven hilft zur Berücksichtigung von Unterschieden zwischen Primer-Sets nehmen, unabhängig davon, wie vorsichtig sie sind entworfen, und auch Effizienz unterscheidenschiede über den Bereich der Template-Konzentrationen für eine Primer-Set. Unser Protokoll ist anders als die anderen, die verfügbar sind 5-8 in die wir ausgiebig decken die später Analysephase.
Das Protokoll über eine robuste Methode zur Quantifizierung von DNA genau Anreicherung von primären Lymphozyten mit ChIP. Ein wichtiger Grund für Robustheit in diesem Protokoll ist die Aufnahme der biologischen Replikate. Die obige Protokoll verwendet drei Wiederholungen, die Anreicherung, für die unabhängig berechnet. Die Ausgänge werden dann gemittelt, um einen Grad der Anreicherung und Standardabweichungen berechnet, um ein Maß der Variabilität bereitzustellen. Für jede Probe repliziert drei technischen auch…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse CA141009 und GM39067 unterstützt. Wir danken E. Parnell und R. Yarrington für Kommentare zu den schriftlichen Teil.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Formaldehyde | Sigma | F-8775 | Store at RT |
Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30256.01 | Store at 4 °C |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 04693116001 | Store at 4 °C |
Protein G magnetic beads | Active Motif | 101945 | Store at 4 °C |
RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | Store at -20 °C |
Proteinase K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Store at -20 °C |
SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | Store at -20 °C |
1 M Glycine | Store at RT | ||
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | Store at 4 °C | ||
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | Store at RT | ||
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | Store at 4 °C | ||
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | Store at 4 °C | ||
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | Prepare fresh | ||
5 M NaCl | Store at RT | ||
0.5 M EDTA | Store at RT | ||
1 M Tris-HCl, pH 6.5 | Store at RT | ||
Table of Specific Reagents | |||
Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Model: 421105 | |
Magnetic Stand | Promega | Z5342 | |
Qiaquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Model: S3000 | |
UV Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
Heating Block | VWR | 13259-030 | |
Rotator | VWR | 80085-692 | |
Refrigerated bench top centrifuge | Beckman Coulter | Model: Allegra X-12R | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
Table of Equipment |