Summary

Akciğer ve Fareler immün Doku Örneklerinde Hasat ile kombinasyon Sağ Ventrikül Sistolik Basınç Ölçümleri

Published: January 16, 2013
doi:

Summary

Aynı anda sağ kalp fonksiyonu, akciğer iltihabı ve bağışıklık yanıtı araştırmak için bir özel ve hızlı bir protokol bir öğrenme aracı olarak tanımlanmaktadır. Video ve rakamlar büyük ölçekli çalışmalara küçük kullanılmak üzere uyarlanabilir bir organize ekip yaklaşımı, fizyoloji ve mikrodiseksiyon teknikleri anlatıyoruz.

Abstract

Sağ kalp fonksiyonu böylece sağ kalp fizyolojisi ve pulmoner vasküler fizyoloji bağlayan, akciğerler aracılığıyla kan pompalamak için. Enflamasyon hücresel infiltrasyon, sitokinler ve büyüme faktörlerinin üretimi, tertipleyerek tarafından ve biçimlenme süreçleri 1 başlatarak, kalp ve akciğer fonksiyon ortak bir düzenleyicidir.

Sol ventrikül ile karşılaştırıldığında, sağ ventrikül basınç değişikliklerinin nispeten dar bir bölgede faaliyet gösteren bir alçak basınç pompası. Artmış pulmoner arter basıncı akciğer vasküler yatak ve pulmoner hipertansiyon 2 içinde basınç artması ile ilişkilidir. Pulmoner hipertansiyon, iltihaplı sık sık akciğer hastalıkları, örneğin kronik obstrüktif akciğer hastalığı, otoimmün hastalıkların ya da 3 ile ilişkilidir. Pulmoner hipertansiyon yaşam ve yaşam beklentisi kalitesi için kötü prognoz bahşeder Çünkü çok araştırma bu mig mekanizmalarının anlaşılması yöneliktirht ilaç müdahalesi 4 için hedefler. Pulmoner hipertansiyon için etkin yönetim araçları geliştirilmesi için temel zorluk, moleküler ve hücresel sağ kalp değişiklikler, akciğer ve bağışıklık sisteminin eş zamanlı anlayış karmaşıklığı kalır.

Burada, farelerin sağ kalp basınç değişiklikleri hızlı ve hassas ölçümü için bir usul iş akışı ve kalp, akciğerler ve bağışıklık dokulardan örnekler eşzamanlı hasat sunuyoruz. Yöntemi ilk pulmoner arter 5-13 baskıların vekil ölçüsü olarak 1990'ların sonunda geliştirilen yakın göğüslü farelerde juguler ven yoluyla sağ ventrikül doğrudan kateterizasyon dayanmaktadır. Organize ekip yaklaşımı çok hızlı bir sağ kalp kateterizasyonu tekniğini kolaylaştırır. Bu da kendiliğinden oda nefes farelerde ölçümlerini yapar. Farklı iş alanlarında iş akışının organizasyonuzaman gecikmesi azaltır ve eşzamanlı fizyolojisi deneyleri ve hasat bağışıklık, kalp ve akciğer dokularında gerçekleştirme imkanı açar.

Burada özetlenen usul akışı büyük ilaç tarama testleri, küçük, hedeflenen deneyler, laboratuvar ortamlarında ve çalışma tasarımları geniş bir yelpazede için adapte edilebilir. Ekokardiyografi 5,14-17 ve kalp, akciğer ve bağışıklık dokuların hasat kapsayacak şekilde genişletildi olabilir kalp fizyolojisi verilerin eşzamanlı edinimi ileri bilimsel bilgi temeli taşımak veri elde etmek için ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltır. Burada sunulan usul iş akışı aynı zamanda bağışıklık, akciğer ve kalp fonksiyonu bağlantı ağları bilgi kazanıyor için ideal bir temel sağlar. Burada özetlenen aynı ilkeler gerektiği gibi başka veya ilave organlar çalışmaya adapte edilebilir.

Protocol

1. Hazırlık Aşağıdaki gibi aşağıdaki çözümler ve borular (Tablo 1) hazırlanması: Hanks çözeltisi, herhangi bir kalsiyum, magnezyum veya gösterge penisilin (100 U / ml) / streptomisin (100 mg / ml). Fosfat salin (PBS), 1x, hiçbir kalsiyum, magnezyum hiçbir tamponlu. Etanol,% 70, 500 ml olun. Formaldehit Buffered, PBS ile% 7-10, 500 ml olun. Anestezi çözümler: Avertin. Dikkatle 2,2,2-Tribromoethanol 5 g 2-Metil-2-but…

Representative Results

Sağ kalp baskı eğrisi elde etmek için birincil sonuç sağ kalp kateteri doğru pozisyon elde edilir. Sağ ventrikül kateter içinin doğru yerleştirme (Şekil 4) basınç yaylaları neden olacağından basınç zaman eğrisinin şekli önemlidir. Spiky eğrileri yerine, sağ ventrikül duvarına solunum veya kalp atım hareketi ile taşınır bir kateter göstermektedir. Hayvanların hayatta kalma evresi ile olası sorunları tespit etmek, ΔP, standart sapma ve kalp hızı hesaplanır gerekmekte…

Discussion

Burada özetlenen deneysel akışı akciğerler, kalp ve farelerde bağışıklık sistemi tepkilerin analizi için sağ ventrikül sistolik basıncı ve numune hasat hızlı ve eş zamanlı olarak ölçülmesini sağlar. Prosedür kalp fizyolojisi ölçümleri, mikro-diseksiyonu ve canlı hücre çalışmaları, histolojik analizler veya dokuların omics-analizi için sonraki doku hasat birleştirir. Tam prosedürü fare başına az 20 dakika sürer. Çünkü işlik organize iş akışının, 2-3 hayvanların aynı and…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R01HL082694 (JW);; Amerikan Kalp Derneği, Kurucular bağlı (0855943D, GG); Bu çalışma Sağlık 1R21HL092370-01 Ulusal Enstitüsü (GG), 1R01 HL095764-01 (GG) tarafından finanse edildi Stony Wold – Herbert Fonu, New York (SHP).

Materials

Name Company Catalogue number Comments (optional)
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

References

  1. Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
  2. Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
  3. Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
  4. Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
  5. Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
  6. Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
  7. Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
  8. West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
  9. Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
  10. West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
  11. Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
  12. Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
  13. Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
  14. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
  15. Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
  16. Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
  17. Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
  18. Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
  19. Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
  20. Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
  21. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
  22. Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
  23. Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
  24. Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
  25. Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
  26. Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
  27. Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
  28. Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
  29. Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).

Play Video

Cite This Article
Chen, W., Park, S., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

View Video