Summary

Rechter ventrikel systolische druk Metingen in combinatie met Harvest van Lung en Immune weefselmonsters in Muizen

Published: January 16, 2013
doi:

Summary

Een specifieke en snelle protocol tegelijkertijd onderzoeken juiste hartfunctie, longontsteking en de immuunrespons wordt beschreven als leermiddel. Video en cijfers beschrijven fysiologie en microdissectie technieken in een georganiseerd team-aanpak die aanpasbaar is om te worden gebruikt voor kleine tot grote studies.

Abstract

De functie van de rechter hart is om bloed rond te pompen door de longen, waardoor het koppelen van rechter hart fysiologie en pulmonaire vasculaire fysiologie. Ontsteking is een gemeenschappelijke modifier van hart en longfunctie, door de uitwerking van cellulaire infiltratie, de productie van cytokines en groeifactoren, en door te remodeling processen 1.

Vergeleken met de linker ventrikel, rechter ventrikel het een lage druk pomp die werkt in een relatief smalle zone van drukveranderingen. Verhoogde pulmonale arteriële bloeddruk gepaard gaan met hogere druk in de long vaatbed en pulmonale hypertensie 2. Pulmonale hypertensie wordt vaak geassocieerd met inflammatoire longziekten, zoals chronische obstructieve longziekte, of auto-immuunziekten 3. Omdat pulmonale hypertensie geeft een slechte prognose voor de kwaliteit van leven en de levensverwachting, is veel onderzoek gericht op het begrijpen van de mechanismen die might doelwit zijn van farmaceutische interventie 4. De voornaamste uitdaging voor de ontwikkeling van effectieve beheersinstrumenten voor pulmonale hypertensie blijft de complexiteit van de gelijktijdige begrip van moleculaire en cellulaire veranderingen in het rechter hart, de longen en het immuunsysteem.

Hier geven we een procedurele workflow voor snelle en nauwkeurige meting van drukveranderingen in het rechter hart van muizen en de gelijktijdige oogst van monsters van hart, longen en immune weefsels. De methode is gebaseerd op de directe catheterisatie van de rechter ventrikel via de halsader in close-chested muizen eerst ontwikkeld in de late jaren 1990 als surrogaat maat voor de druk in de longslagader 5-13. De georganiseerde team-aanpak vergemakkelijkt een zeer snelle recht hartkatheterisatie techniek. Dit maakt het mogelijk de metingen uit te voeren in muizen die spontaan ademen kamerlucht. De organisatie van de work-flow in verschillende werk-gebiedenvermindert de vertraging en opent de mogelijkheid om gelijktijdig uit te voeren fysiologie experimenten en oogst immuunsysteem, hart en longen.

De workflow hier geschetste procedure kan worden aangepast voor een groot aantal laboratoriumsituatie en studie ontwerpen van kleine, gerichte experimenten om grote drugtesten. De gelijktijdige aankoop van hartfysiologie gegevens die kunnen worden uitgebreid tot echocardiografie 5,14-17 en oogst van hart-, long-en immuunsysteem weefsels bevatten vermindert het aantal dieren dat nodig is om de gegevens die de wetenschappelijke kennisbasis vooruit te krijgen. De procedurele workflow hier gepresenteerde biedt ook een ideale basis voor het verwerven van kennis van de netwerken die immuun-, long-en hartfunctie te koppelen. Dezelfde principes hier beschreven kan worden aangepast aan andere of aanvullende organen bestuderen nodig.

Protocol

1. Voorbereiding Bereid de volgende oplossingen en buizen (Tabel 1) als volgt: Hanks oplossing, geen calcium, magnesium of indicator met penicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 mg / ml). Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 1x, geen calcium, magnesium no. Ethanol, 70%, 500 ml maken. Gebufferde formaldehyde, 7-10% met PBS, maken 500 ml. Anesthesie-oplossingen: Avertin. Voeg voorzichtig 5 ml 2-Methyl-2-butanol met 5 g 2,2,2-trib…

Representative Results

Het primaire resultaat voor het verkrijgen van goede hart drukcurven wordt bereikt door de juiste positie van het rechter hart katheter. De vorm van de druk tijdcurve is kritiek omdat de juiste plaatsing van de katheter in de rechter ventrikel leidt tot druk plateaus (figuur 4). Spiky curves daarentegen blijkt een katheter die wordt bewogen door de ademhaling of hartslag beweging tegen de wand van de rechter hartkamer. Teneinde mogelijke problemen met de fase van overleving van de dieren, de standaardaf…

Discussion

De experimentele stroom hier beschreven zorgt voor een snelle en gelijktijdige meting van systolische rechterventriculaire druk en oogsten van monsters voor analyse van de reacties in de longen, het hart en het immuunsysteem in muizen. De procedure combineert hart fysiologie metingen, micro-dissectie en de daaropvolgende weefsel oogst voor levende cellen onderzoeken is een histologische analyse, of omics-analyse van de weefsels. De hele procedure duurt minder dan 20 minuten per muis. Door het werk-gebied georganiseerde …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW); American Heart Association, oprichters affiliate (0855943D, GG); Stony Wold – Herbert Fonds, New York (SHP).

Materials

Name Company Catalogue number Comments (optional)
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

References

  1. Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
  2. Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
  3. Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
  4. Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
  5. Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
  6. Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
  7. Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
  8. West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
  9. Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
  10. West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
  11. Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
  12. Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
  13. Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
  14. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
  15. Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
  16. Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
  17. Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
  18. Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
  19. Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
  20. Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
  21. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
  22. Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
  23. Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
  24. Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
  25. Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
  26. Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
  27. Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
  28. Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
  29. Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).

Play Video

Cite This Article
Chen, W., Park, S., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

View Video