Questo metodo indaga la piastrinica mediata fenotipo aggregazione di<em> Plasmodium falciparum</em>-Infetti eritrociti (pRBC) in isolati clinici. Ciò avviene isolando e co-incubando plasma ricco di piastrine e una sospensione di pRBC.
P. falciparum causa la maggior parte dei gravi infezioni malariche. I meccanismi fisiopatologici alla base malaria cerebrale (CM) non sono pienamente compresi e diverse ipotesi sono state avanzate, tra cui ostruzione meccanica dei microvasi di P. globuli rossi falciparum-parassitati (pRBC). Infatti, durante la fase intra-eritrocitaria del suo ciclo di vita, P. falciparum ha la capacità unica di modificare la superficie del eritrociti infetto esportando antigeni di superficie con diverse proprietà adesive sulla membrana RBC. Questo permette al sequestro di pRBC in molteplici tessuti e organi per adesione alle cellule endoteliali che rivestono il microcircolo delle venule post-capillari 1. Così facendo, le forme mature del parassita evitano liquidazione splenica degli eritrociti infetti deformata 2 e limitano il loro ambiente per una più favorevole bassa pressione di ossigeno 3. Come conseguenza di questa SEQUESTrazione, è solo parassiti asessuati immaturi e gametociti che possono essere rilevati nel sangue periferico.
Cytoadherence e sequestro di pRBC maturo ai numerosi recettori ospitanti espressi su letti microvascolari si verifica nella malattia grave e senza complicazioni. Tuttavia, diverse linee di evidenza suggeriscono che solo fenotipi adesive specifiche sono suscettibili di essere associati con esiti patologici gravi di malaria. Un esempio di tali specifiche interazioni ospite-parassita è stata dimostrata in vitro, in cui la capacità della molecola di adesione intercellulare-1 per supportare legame di pRBC con particolari proprietà adesive è stato collegato allo sviluppo di malaria cerebrale 4,5. La placenta è stato riconosciuto anche come sito preferenziale di accumulo pRBC nelle donne in gravidanza con infezione da malaria, con Chondrotin solfato Un espresso in sinciziotrofoblasti quella linea spazio intervilloso placentare come il principale recettore 6. Rosette di pRBC teritrociti non infetti o attraverso il recettore del complemento a 1 (CD35) 7,8 è stata anche associata con grave malattia 9.
Uno dei più recentemente descritta P. falciparum fenotipi cytoadherence è la capacità del pRBC per formare grumi piastrinica in vitro mediata. La formazione di tali ciuffi pRBC richiede CD36, una glicoproteina espressa sulla superficie delle piastrine. Altro recettore umano, gC1qR/HABP1/p32, espressa su diversi tipi cellulari, comprese le cellule endoteliali e piastrine, è stato anche dimostrato per facilitare l'adesione pRBC su piastrine per formare grumi 10. Se invece ciò avvenga in vivo è ancora chiaro, ma potrebbe spiegare la notevole accumulo di piastrine descritte nel microcircolo cerebrale dei bambini del Malawi che sono morti da cm 11. Inoltre, la capacità del clinico di isolare le colture a raggrupparsi in vitro era direttamente legata alla gravità della malattia in Malawi 12 </sup> E pazienti del Mozambico 13, (anche se non in Mali 14).
Con diversi aspetti del fenotipo aggregazione pRBC poco caratterizzato, studi in corso su questo argomento non hanno seguito una procedura standardizzata. Questo è un tema importante per la nota alta variabilità insita nel test 15. Qui vi presentiamo un metodo per l'aggregazione piastrinica in vitro mediata da P. falciparum con la speranza che possa fornire una piattaforma per un metodo coerente per altri gruppi e aumentare la consapevolezza dei limiti di indagare questo fenotipo in studi futuri. Essendo basato in Malawi, forniamo un protocollo specifico per un ambiente risorsa limitata, con il vantaggio che gli isolati clinici di fresco raccolti possono essere esaminati per fenotipo senza necessità di crioconservazione.
Abbiamo descritto un saggio aggregazione piastrinica mediata usato per studiare pRBC in isolati clinici direttamente in campo. Aggregazione piastrinica mediata, un comportamento caratteristico in P. isolati clinici falciparum, è stato identificato come un fenotipo distinto adesivo, frequenti negli isolati CD36 vincolanti 12,23-24. Abbiamo usato questo test per identificare i tre punti principali: 1) una forte aggregazione in vitro fenotipo di P. falciparum isolato dai bambini del Malawi che è associato con la gravità della malattia e la diagnosi 2) nuovo recettore P-selectina mediaties clumping sulle piastrine insieme a CD36, 3) il grado di trombocitopenia presenti in pazienti con CM è sufficiente limitare l'ulteriore formazione di grumi PRBC in vitro 12. Il coinvolgimento delle piastrine in formazione ciuffo è dimostrata esaminando una preparazione umido-slide come descritto nel capitolo 6. Le piastrine possono essere isolati da PRP per centrifugazione a velocità elevateal fine di minimizzare reazioni antigenici gruppi sanguigni, tuttavia, abbiamo utilizzato tutta PRP per minimizzare prematura attivazione piastrinica da movimenti eccessivi e dalla centrifugazione ad alta velocità. Attività delle piastrine può essere misurata mediante test di aggregazione piastrinica mediante deboli agonisti piastrinici, epinefrina o adenosina difosfato (ADP) 25 come descritto in 26.
Ci sono diversi aspetti del test che sono stati in precedenza scarsamente caratterizzati, uno dei quali è l'importanza di selezionare fonti PRP e l'effetto dei gruppi di antigeni del sangue sul risultato del test. Abbiamo preparato PRP da individui che erano il gruppo sanguigno O + e non aveva preso alcun farmaco negli ultimi 7-10 giorni prima che il sangue viene prelevato da alcuni farmaci possono influenzare il comportamento delle piastrine.
Altri fattori che possono influenzare la formazione di grumi di successo includono pRBC ematocrito, i livelli di parassitemia e la durata del test aggregazione. Utilizzando ematocrito alto e co piastriniciunt sarebbe difficile dire se il cluster è veramente un ciuffo o se troppe cellule sono semplicemente seduti insieme perché sono densamente 15. Aggregazione anche generalmente aumenta con tempi di incubazione più lunghi. Questi sono tutti utili linee guida che devono essere considerati durante la progettazione di studi di grumi.
Troviamo che i campioni provenienti da diversi gruppi clinici possono essere analizzati in parallelo utilizzando PRP dallo stesso donatore se è possibile farlo, ma in contesti di risorse limitate, come i siti di campo la piscina trasfusione è generalmente limitato. È quindi difficile avere un singolo donatore O + per standardizzare i saggi. Abbiamo quindi identificato diverse O + donatori per garantire la compatibilità di gruppo sanguigno, ove possibile. L'utilizzo di più donatori è utile anche in caso di grandi campioni di dimensioni in modo tale onere della donazione di sangue non dovesse cadere in un solo individuo.
Punti di campionamento nei 15-20 minuti sono molto più fattibile se un singolo person sta conducendo le analisi, consentendo per i preparati wet-scivolo e l'esecuzione di analisi cinetica senza tempi di campionamento che si sovrappongono. Maggior parte dei dati microscopico è visivo e alquanto oggettivo, quindi, è importante che il conteggio delle cellule è verificato da più di una persona. In quel caso, la manipolazione di un campione alla volta può permettere un'analisi completa di tre-quattro campioni al giorno a seconda dell'efficienza personale.
Agglomerante piastrinica mediata può essere eseguita utilizzando sia clinici di laboratorio e isolati. Per le linee di laboratorio, si consiglia di CD36 parassiti vincolanti sono utilizzati per ottimizzare le frequenze grumi. Il dosaggio può essere accoppiato con altri test di agglutinazione quali rosette o utilizzato in saggi di inibizione aggregazione che consentano lo studio dei recettori sulle piastrine che possono mediare vincolante pRBC, un aspetto poco compreso ed esaminato di questo fenotipo.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato reso possibile da un finanziamento della Wellcome Trust. JM (080.964) e SCW (080.948) sono stati sostenuti dal Wellcome Trust borse e DT da una Malawi-Liverpool Wellcome Trust borsa di studio.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |