Cette méthode étudie le phénotype agglutination des plaquettes induite par des<em> Plasmodium falciparum</em> Infectées érythrocytes (CGR) dans les isolats cliniques. Ceci est réalisé en isolant et en co-incubation de plasma riche en plaquettes et d'une suspension de CGR.
P. falciparum est responsable de la majorité des infections paludéennes graves. Les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent le neuropaludisme (CM) ne sont pas entièrement comprises et plusieurs hypothèses ont été avancées, notamment une obstruction mécanique des microvaisseaux par P. globules rouges parasités falciparum (CGR). En effet, lors de la phase intra-érythrocytaire de son cycle de vie, P. falciparum a la capacité unique de modifier la surface des érythrocytes infectés par l'exportation des antigènes de surface avec différentes propriétés d'adhérence sur la membrane des globules rouges. Cela permet à la séquestration de CGR dans de nombreux tissus et organes par adhésion aux cellules endothéliales qui tapissent la microvascularisation des veinules post-capillaires 1. Ce faisant, les formes matures du parasite éviter dégagement splénique des globules rouges déformés infectés 2 et limitent leur environnement pour une plus favorable faible pression d'oxygène 3. En conséquence de cette sequestration, il est seulement parasites et les gamétocytes qui peuvent être détectés dans le sang périphérique asexués immatures.
Cytoadhérence et la séquestration du pRBC mature pour les nombreux récepteurs de l'hôte exprimées sur des lits microvasculaires survient dans la maladie grave et sans complication. Toutefois, plusieurs éléments de preuve suggèrent que seuls les phénotypes adhésifs spécifiques sont susceptibles d'être associées à des résultats pathologiques graves de paludisme. Un exemple de ces interactions hôte-parasite spécifique a été démontrée in vitro, où la capacité de la molécule-1 d'adhésion intercellulaire pour soutenir liaison de pRBC avec notamment des propriétés adhésives a été liée au développement du neuropaludisme 4,5. Le placenta a également été reconnu comme un site d'accumulation pRBC préférentiel chez les femmes enceintes infectées par le paludisme, avec chondroïtine sulfate A exprimée sur syncytiotrophoblastes qui bordent la chambre intervilleuse placentaire que le récepteur principal 6. Rosettes de pRBC to érythrocytes non infectés par le récepteur du complément 1 (CD35) 7,8 a également été associée à une maladie grave 9.
Un des P. décrit plus récemment falciparum phénotypes cytoadhérence est la capacité de la décharge afin de former des touffes à médiation plaquettaire in vitro. La formation de ces amas CGR nécessite CD36, une glycoprotéine exprimée à la surface des plaquettes. Un autre récepteur humain, gC1qR/HABP1/p32, exprimée sur divers types de cellules, y compris les cellules endothéliales et les plaquettes, a également été montré pour faciliter l'adhérence pRBC sur les plaquettes à former des amas 10. Si elles s'agrègent in vivo reste incertain, mais il pourrait expliquer l'accumulation importante de plaquettes décrites dans microvascularisation cérébrale des enfants du Malawi qui sont morts de CM 11. En outre, la capacité d'isolat clinique cultures à s'agglutiner in vitro est directement liée à la gravité de la maladie dans malawite 12 </sup> Et patients mozambicains 13, (mais pas dans malien 14).
Avec plusieurs aspects du phénotype agglutination pRBC mal caractérisés, les études actuelles sur ce sujet n'ont pas suivi une procédure standardisée. C'est une question importante en raison de la grande variabilité inhérente connue dans le test 15. Ici, nous présentons une méthode in vitro pour agglutination des plaquettes médiée par P. falciparum avec l'espoir qu'elle fournira une plate-forme pour une méthode cohérente pour les autres groupes et de sensibiliser les limitations à enquêter sur ce phénotype dans les études futures. Étant basé au Malawi, nous fournissons un protocole spécifiquement conçu pour une mise de ressources limitées, avec l'avantage que les isolats cliniques fraîchement récoltées peuvent être examinées pour phénotype sans avoir besoin de cryoconservation.
Nous avons décrit un test agglutination des plaquettes médiée utilisé pour l'étude pRBC dans des isolats cliniques directement sur le terrain. Agglutination des plaquettes induite, un comportement caractéristique de P. isolats cliniques falciparum, a été identifié comme un phénotype adhésif distinct, fréquents dans les isolats CD36 contraignantes 12,23-24. Nous avons utilisé ce test pour identifier les trois points principaux: 1) une forte agglutination dans le phénotype in vitro de P. falciparum isolé enfants malawites qui est associé à la gravité de la maladie et le diagnostic 2) de nouveaux récepteurs de mediaties P-sélectine agglutination sur les plaquettes avec CD36, 3) le degré de thrombocytopénie présente chez les patients atteints CM est suffisante pour limiter la formation ultérieure des touffes CGR dans vitro 12. L'implication des plaquettes dans la formation de touffe est démontrée par l'examen d'une préparation humide glissière comme décrit dans la section 6. Les plaquettes peuvent être isolés à partir de PRP par centrifugation à grande vitesseafin de minimiser les réactions antigéniques des groupes sanguins, mais nous avons utilisé toute la PRP afin de minimiser prématuré activation plaquettaire d'une manipulation excessive et de la centrifugation à grande vitesse. L'activité plaquettaire peut être mesurée par un test d'agrégation plaquettaire en utilisant faibles agonistes plaquettaires, l'adrénaline ou l'adénosine diphosphate (ADP) 25 comme décrit dans 26.
Il ya plusieurs aspects de l'essai qui ont déjà été mal caractérisées, l'un d'entre eux étant l'importance de la sélection des sources PRP et l'effet des groupes d'antigènes sanguins sur les résultats de l'analyse. Nous avons préparé PRP de personnes qui étaient du groupe sanguin O + et n'avait pas pris de médicaments dans les derniers jours 7-10 avant de sang est prélevé comme certains médicaments peuvent affecter le comportement des plaquettes.
D'autres facteurs qui peuvent influer sur l'agglutination succès incluent pRBC hématocrite, les niveaux de parasitémie et la durée de l'essai agglutination. Utiliser hématocrite élevé et co plaquettairesUNT, il serait difficile de dire si le groupe est vraiment une touffe ou si trop de cellules sont simplement assis ensemble parce qu'ils sont denses 15. Généralement agglutination augmente également avec des temps d'incubation plus longs. Ce sont toutes des indications utiles qui devraient être considérés lors de la conception des études en suspension.
Nous constatons que les échantillons provenant de différents groupes cliniques peuvent être analysés en parallèle en utilisant PRP provenant du même donneur s'il est possible de le faire, mais dans des contextes de ressources limitées telles que les sites sur le terrain de la piscine de transfusion est généralement limitée. Il est donc difficile d'avoir un seul donateur + O pour standardiser les tests. Nous avons donc identifié plusieurs O + donateurs pour assurer la compatibilité du groupe sanguin mesure du possible. L'utilisation de plusieurs bailleurs de fonds est également utile dans les cas de grandes tailles d'échantillons de sorte que le fardeau du don de sang ne tombe pas sur une seule personne.
Les points de prélèvement à 15-20 min sont beaucoup plus réalisable que si une seule person effectue les dosages, ce qui permet des préparations humide diapositives et effectuer cinétique de dosage sans temps d'échantillonnage qui se chevauchent. La plupart des données microscopique est visuel et peu objective, par conséquent, il est important que le comptage des cellules est vérifiée par plus d'une personne. Dans ce cas, la manipulation d'un échantillon à la fois peut permettre une analyse complète de trois à quatre échantillons par jour en fonction de l'efficacité personnelle.
Agglutination des plaquettes à médiation peut être effectuée en utilisant les deux isolats cliniques et de laboratoire. Pour les lignes de laboratoire, il est recommandé de CD36 parasites obligatoires sont utilisés pour optimiser les fréquences agglutination. Le dosage peut être couplé avec d'autres tests d'agglutination comme rosettes ou utilisés dans l'agglutination des essais d'inhibition qui permettraient à l'étude des récepteurs sur les plaquettes qui peuvent médier contraignant pRBC, un aspect mal connu et étudié de ce phénotype.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été rendu possible grâce au financement du Wellcome Trust. JM (080 964) et SCW (080 948) ont été soutenus par des bourses du Wellcome Trust et DT par une bourse d'affectation spéciale Malawi-Liverpool-Wellcome.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |