שיטה זו חוקרת את הפנוטיפ הצטברויות טסיות דם בתיווך של<em> Plasmodium falciparum</em> נגועים באריתרוציטים (pRBC) קליני מבודדים. זה מבוצע על ידי בידוד ולשתף דוגרים פלזמה טסיות דם עשיר ובהשעיה של pRBC.
פ falciparum גורם למרבית זיהומי מלריה חמורים. את המנגנונים שבבסיס pathophysiological מלריה מוחית (CM) לא הבינו באופן מלא וכבר הכניסו כמה השערות קדימה, כולל חסימה מכאנית של microvessels על ידי פ ' תאי דם אדומים falciparum-parasitized (pRBC). ואכן, בשלב התוך האריתרוציטים של מחזור החיים שלו, פ יש falciparum היכולת הייחודית לשנות את פני השטח של הכדורית האדומה הנגוע על ידי יצוא פני שטח אנטיגנים שונים עם מאפיינים דבקים על הממברנה RBC. זה מאפשר התפיסה של pRBC ברקמות ואיברים מרובים על ידי הידבקות לתאי האנדותל המצפים את microvasculature של venules לאחר נימי 1. בעשותם כך, הצורות בוגרות של הטפיל למנוע אישור הטחול של אריתרוציטים מעוותים הנגועים 2 ולהגביל את הסביבה שלהם ללחץ חמצן נמוך יותר נוח 3. כתוצאה מזה SEQUESTמנה, זה רק טפילי זוויגיים לא בשלה וgametocytes שניתן לאתר בדם היקפי.
Cytoadherence ותפיסה של pRBC הבוגרת לקולטנים המארחות הרבים הביעו במיטות כלי הדם מתרחש במחלה קשה ולא מסובכת. עם זאת, כמה שורות של ראיות מצביעות על כך שרק פנוטיפים דבק ספציפיים עשויים להיות קשור עם תוצאות פתולוגיים חמורות של מלריה. אחת דוגמאות לאינטראקציות מארח טפילות ספציפיות כאלה הוכח במבחנה, בו היכולת של מולקולת 1-הידבקות אינטר לתמוך מחייב של pRBC עם מאפייני דבק מסוימים נקשרה להתפתחות של קדחת מוח 4,5. השליה גם הוכרה כאתר של הצטברות pRBC מועדפת בנשים הרות שנדבקו במלריה, עם chondrotin סולפט המרפדים את חלל השליה intervillous כקולט העיקרי 6 הביע בsyncytiotrophoblasts. Rosetting של pRBC לאאריתרוציטים נגועים o באמצעות קולט משלים 1 (CD35) 7,8 גם היו קשורים עם מחלה קשה 9.
אחד פ 'תאר לאחרונה פנוטיפים cytoadherence falciparum הוא היכולת של pRBC כדי ליצור גושים טסיות בתיווך במבחנה. היווצרות של גושי pRBC כאלה דורשת CD36, גליקופרוטאין הביע על פני השטח של טסיות דם. אחר הקולטן אנושי, gC1qR/HABP1/p32, הביע בתאים מסוגים שונים, כולל תאי אנדותל וטסיות דם, גם הוכח כדי להקל על הידבקות pRBC על טסיות דם כדי ליצור גושי 10. בין אם clumping מתרחש in vivo עדיין לא ברור, אבל זה עשוי להסביר את ההצטברות המשמעותית של טסיות דם המתוארים בmicrovasculature המוח של ילדים שמתו ממלאווי 11 ס"מ. בנוסף, היכולת של בודד תרבויות קליניות לגוש במבחנה היה קשור ישירות לחומרת מחלה ב12 Malawian </sup> וMozambican חולים 13, (אם כי לא בMalian 14).
עם כמה היבטים של הפנוטיפ הצטברויות pRBC המאופיין היטב, מחקרים עכשוויים בנושא זה לא הלכו הליך סטנדרטי. זה נושא חשוב, בגלל השונות גבוהות הידועה הגלומות בassay 15. כאן, אנו מציגים שיטה בהצטברויות טסיות דם בתיווך במבחנה של פ falciparum עם תקווה שזה יספק פלטפורמה לשיטה עקבית לקבוצות אחרות, ולהעלות את המודעות למגבלות בחקירת פנוטיפ זה במחקרים עתידיים. שבסיסה במלאווי, אנו מספקים פרוטוקול שתוכנן במיוחד להגדרת משאב מוגבלת, עם היתרון שניתן לבדוק קליני מבודדים טריים שנאסף לפנוטיפ ללא צורך בשימור בהקפאה.
יש לנו תאר assay הצטברויות טסיות דם בתיווך המשמש ללימוד pRBC קליני מבודדים באופן ישיר בתחום. הצטברויות טסיות דם בתיווך, התנהגות אופיינית בפ קליני מבודדים falciparum, זוהה כדבק פנוטיפ מובחן, תכוף בבידודי CD36 מחייבים 12,23-24. יש לנו בשימוש assay זה לזהות שלוש נקודות עיקריות: 1) חזקות בפנוטיפ clumping המבחנה של פ falciparum מבודד מילדי Malawian הקשורים לחומרת מחלה ואבחון 2) mediaties P-selectin קולט הרומן נחבט בטסיות יחד עם CD36, 3) מידת טרומבוציטופניה הנוכחית בחולים עם סי די בכך כדי להגביל את היווצרות נוספת של גושים בpRBC 12 חוץ גופית. המעורבות של טסיות דם בהיווצרות הגוש באה לידי ביטוי על ידי בחינת הכנה רטובה שקופית כפי שמתואר בסעיף 6. יכולות להיות מבודדות מטסיות PRP על ידי צנטריפוגה במהירויות גבוהותעל מנת למזער תגובות antigenic קבוצת דם, עם זאת, היינו כולו PRP על מנת למזער מוקדמת הפעלת טסיות דם מטיפול מוגזם ומצנטריפוגה במהירות גבוהה. פעילות טסיות דם ניתן למדוד על ידי בדיקת הצטברות טסיות דם באמצעות אגוניסטים חלשים טסיות דם, אפינפרין או diphosphate אדנוזין (ADP) 25 כפי שתואר ב26.
ישנם כמה היבטים של assay כי בעבר כבר מאופיינת בצורה גרועה, אחד מהם הוא החשיבות של בחירת מקורות PRP וההשפעה של קבוצות אנטיגן דם על התוצאה של assay. הכנו PRP מאנשים שהיו קבוצת הדם O + ולא לקחנו תרופה כלשהי בימים האחרונים לפני 7-10 דם נמשך כחלק מתרופות יכולות להשפיע על התנהגות של טסיות דם.
גורמים נוספים שעשויים להשפיע על הצלחה כוללים clumping pRBC המטוקריט, רמות parasitaemia ואורך של assay ההצטברויות. שימוש המטוקריט גבוה ושיתוף טסיותUNT זה יהיה קשה לדעת אם האשכול הוא באמת גוש או אם יותר מדי תאים רק יושבים יחד משום שהם צפופים 15. Clumping גם בדרך כלל עולה עם פעמים דגירה ארוכות יותר. כל אלה הם הקווים המנחים השימושיים שיש לשקול בעת תכנון מחקרי התקבצות.
אנו מוצאים כי דגימות מקבוצות קליניות שונות ניתן לנתח במקביל באמצעות PRP מאותו התורם אם זה אפשרי לעשות זאת, אבל בהגדרות משאב מוגבלות כגון אתרי שדה בריכת העירוי מוגבלת בדרך כלל. לכן זה קשה לי + תורם O יחיד לתקנן את מבחני. לפיכך, אנו זיהינו + O כמה תורמים כדי להבטיח תאימות קבוצת דם בכל מקום אפשרי. שימוש במספר רב של תורמים הוא גם מועיל במקרים של גדלי דגימות גדולים כל כך שהניטל של תרומת דם אינו נופל על אדם אחד בלבד.
נקודות דגימה ב15-20 דקות הן הרבה יותר ריאלי אם PE בודדrson עורך את מבחני, מה שמאפשר להכנות רטובות שקופיות וביצוע קינטיקה assay ללא דגימה פעמים החופפות. רוב הנתונים מיקרוסקופי הוא חזותי ואובייקטיבי במידה מסוימת, ולכן, חשוב שספירת תאים מאומתת על ידי יותר מאדם אחד. במקרה כזה, טיפול במדגם אחד בכל פעם יכול לאפשר ניתוח של שלוש עד ארבע דגימות יום, תלוי ביעילות אישית מלא.
ניתן לבצע התכנסות בטסיות דם בתיווך באמצעות שני קליניים ומבודדים במעבדה. לקווי מעבדה, מומלץ שCD36 טפילים מחייבים משמשים כדי למקסם את תדרי clumping. Assay יכול להיות בשילוב עם מבחני התלכדות אחרים כגון rosetting או בשימוש בצעדים כבדים מבחני עיכוב שיאפשר המחקר של רצפטורים על טסיות הדם שעשוי לתווך מחייב pRBC, היבט הבין היטב ובחן של פנוטיפ זה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו התאפשרה הודות למימון מקרן Wellcome. JM (080,964) וSCW (080,948) נתמכו במלגות Wellcome Trust וDT על ידי מלגת לימודים לנאמנות מלאווי-ליברפול-Wellcome.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |