Per studiare il mutualismo tra<em> Xenorhabdus</em> Batteri e<em> Steinernema</emNematodi>, i metodi sono stati sviluppati per monitorare la presenza di batteri e posizione all'interno nematodi. L'approccio sperimentale, che può essere applicata ad altri sistemi, comporta batteri ingegneria per esprimere la proteina fluorescente verde e visualizzazione, utilizzando batteri microscopia a fluorescenza all'interno del nematode trasparente.
Simbiosi, la convivenza di due o più organismi, sono diffusi in tutti i regni della vita. Come due dei microrganismi più diffusi sulla terra, nematodi e batteri formano una vasta gamma di associazioni simbiotiche che vanno dal vantaggioso per patogeni 1-3. Una tale associazione è il rapporto di reciproco beneficio tra i batteri e nematodi Xenorhabdus Steinernema, che è emerso come un sistema modello di simbiosi 4. Nematodi Steinernema sono entomopatogeno, usando il loro simbionte batterico per uccidere gli insetti 5. Per la trasmissione tra gli host di insetti, i batteri colonizzano l'intestino dello stadio infettivo del nematode del giovanile 6-8. Recentemente, diverse specie di nematodi altri hanno dimostrato di utilizzare i batteri per uccidere insetti 9-13, ed indagini hanno iniziato a esaminare le interazioni tra i nematodi e batteri in questi sistemi <sup> 9.
Si descrive un metodo per la visualizzazione di un simbionte batterico all'interno o su un host nematode, sfruttando la trasparenza ottica di nematodi quando visti al microscopio. I batteri sono progettati per esprimere una proteina fluorescente, consentendo loro visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza. Sono disponibili molti plasmidi che portano geni che codificano proteine che reagiscono a lunghezze d'onda differenti (verde o rossa), e la coniugazione dei plasmidi da un ceppo di Escherichia coli in un donatore simbionte destinatario batterica è successo per una vasta gamma di batteri. I metodi descritti sono stati sviluppati per indagare l'associazione tra Steinernema carpocapsae e Xenorhabdus nematophila 14. Metodi simili sono stati utilizzati per studiare altri nematodi batterio associazioni 9, 15-18 e l'approccio è quindi generalmente applicabile.
La method consente la caratterizzazione della presenza di batteri e localizzazione all'interno nematodi a diversi stadi di sviluppo, fornendo approfondimenti sulla natura dell'associazione e il processo di colonizzazione 14, 16, 19. Analisi microscopica rivela sia colonizzazione frequenza all'interno di una popolazione di batteri e localizzazione per ospitare tessuti 14, 16, 19-21. Questo è un vantaggio rispetto ad altri metodi di monitoraggio batteri all'interno popolazioni di nematodi, come sonicazione 22 o molatura 23, che possono fornire livelli medi di colonizzazione, ma non può, per esempio, discriminare popolazioni con una frequenza elevata di bassi carichi simbionti da popolazioni con una bassa frequenza di carichi elevati simbionti. La discriminazione della frequenza e del carico di batteri colonizzatori può essere particolarmente importante quando lo screening o la caratterizzazione di mutanti batterici fenotipi colonizzazione 21, 24. Infatti, microscopia a fluorescenza è stato utilizzato in screening ad alta di mutanti batterici per difetti di colonizzazione 17, 18, ed è meno laborioso rispetto ad altri metodi, compreso sonicazione 22, 25-27 e dissezione nematode individuale 28, 29.
Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per la rilevazione ottica di batteri all'interno di un host nematode (Figura 1). Questo metodo sfrutta la trasparenza ottica di nematodi e la capacità di etichetta fluorescente batteri, consentendo l'analisi in vivo di batteri all'interno dell'ospite nematode (Figura 3). In particolare, questo approccio identifica localizzazione batterica all'interno del suo ospite. Contando una popolazione di nematodi e scorin…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Zucchero, Eric Stabb, e Todd Ciche per il loro contributo allo sviluppo di questo protocollo e gli strumenti usati. KEM e JMC sono stati sostenuti dal National Institutes of Health (NIH) Premio Nazionale Servizio di Ricerca T32 (AI55397 "Microbi nella salute e nella malattia"). JMC è stato supportato da una National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Science Foundation (IOS-0920631 e IOS-0950873).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
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Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
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Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
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Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
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Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |