Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

Summary

Um die Mutualismus zwischen studieren<em> Xenorhabdus</em> Bakterien und<em> Steinernema</em> Nematoden, Methoden wurden entwickelt, um bakterielle Präsenz und Position innerhalb Nematoden überwachen. Der experimentelle Ansatz, der auf andere Systeme angewendet werden kann, bringt Engineering Bakterien das grün fluoreszierende Protein exprimieren und zu visualisieren, mittels Fluoreszenzmikroskopie Bakterien innerhalb des transparenten Nematoden.

Abstract

Symbiosen, das Zusammenleben von zwei oder mehr Organismen sind in allen Reichen des Lebens verbreitet. Als zwei der am weitesten verbreiteten Organismen auf der Erde bilden Nematoden und Bakterien eine breite Palette von symbiotische Assoziationen, die von Vorteil für pathogene ^1-3. Eine solche Vereinigung ist die gegenseitig vorteilhafte Beziehung zwischen Xenorhabdus Bakterien und Steinernema Nematoden, die als Modellsystem Symbiose ⁴ entstanden ist. Steinernema Nematoden sind entomopathogenen, indem sie ihre bakteriellen Symbionten zu töten Insekten ^5. Für die Übertragung von Insekten Gastgeber, besiedeln die Bakterien im Darm der Nematoden der infektiösen jugendlichen Stadium ^6-8. In jüngster Zeit haben mehrere andere Nematoden wurde gezeigt, dass Bakterien nutzen zu töten Insekten ^9-13, und Untersuchungen haben begonnen Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den Nematoden und Bakterien in diesen Systemen <sup> 9.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung eines bakteriellen Symbionten innerhalb oder auf einer Nematode Host, unter Ausnutzung der optischen Transparenz der Nematoden, wenn durch Mikroskopie angesehen. Die Bakterien werden konstruiert, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren, wodurch deren Visualisierung durch Fluoreszenzmikroskopie. Viele Plasmide zur Verfügung, die für Proteine ​​kodierenden Genen tragen, die bei verschiedenen Wellenlängen (dh grün oder rot), und die Konjugation von Plasmiden aus einer Escherichia coli Donor-Stamm in einen Empfänger bakteriellen Symbionten fluoreszieren erfolgreich ist für ein breites Spektrum von Bakterien. Die beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um den Zusammenhang zwischen Steinernema carpocapsae und Xenorhabdus nematophila ¹⁴ zu untersuchen. Ähnliche Verfahren sind verwendet worden, um andere nematodeninduzierbares Bakterium Assoziationen ^{9, 15-18} untersuchen und der Ansatz ist deshalb allgemein anwendbar.

Der method ermöglicht die Charakterisierung von bakteriellen Präsenz und Lokalisierung innerhalb Nematoden in verschiedenen Stadien der Entwicklung, Einblicke in die Natur des Vereins und der Prozess der Kolonisierung ^{14, 16, 19.} Mikroskopischen Analyse ergibt sowohl Kolonisierung Frequenz innerhalb einer Population von Bakterien und Lokalisierung von Geweben ^{14, 16, 19-21} hosten. Dies ist ein Vorteil gegenüber anderen Methoden zur Überwachung Bakterien innerhalb Nematodenpopulationen, wie Ultraschallbehandlung ²² oder Schleifen ^23, die Durchschnittswerte der Besiedlung bestimmt, die aber nicht zum Beispiel diskriminieren Populationen mit einer hohen Frequenz von niedrigen Lasten aus symbiont Populationen mit eine niedrige Frequenz von hoher Symbionten Lasten. Unterscheiden der Frequenz und der Last besiedelnden Bakterien kann besonders wichtig bei der Durchmusterung oder Charakterisierung bakteriellen Mutanten zur Besiedelung Phänotypen ^{21, 24.} Tatsächlich hat Fluoreszenzmikroskopie in Hochdurchsatzscreening von bakteriellen Mutanten für Defekte in Kolonisierung ^{17, 18} eingesetzt, und ist weniger aufwendig als andere Verfahren, einschließlich Ultraschallbehandlung ^{22, 25-27} und Nematoden einzelnen Dissektion ^{28, 29.}

Protocol

Ein. Bau eines Fluorescent Bakterienstamm via Konjugation Wachsen die Rezipientenstamm (Symbionten untersucht werden) und Donorstamm Nacht. Die Donorstamm, üblicherweise Escherichia coli, sollte fähig sein abgebenden DNA durch Konjugation und sollte mit einem Plasmid transformiert werden (Tabelle 2), die ein Gen für ein fluoreszierendes Protein trägt. Abhängig von dem Plasmid kann ein Konjugation Helferstamm auch erforderlich sein. Wenn ja, sollte dieser Stamm auch über Nacht g…

Discussion

Die hier beschriebene Protokoll stellt ein Verfahren zur optischen Detektion von Bakterien in einer Nematode Host (Abbildung 1). Diese Methode nutzt die optische Transparenz von Nematoden und die Fähigkeit zur Fluoreszenz-Label Bakterien, mit der in vivo-Analyse von Bakterien innerhalb des Nematoden Host (Abbildung 3). Insbesondere, identifiziert dieser Ansatz bakteriellen Lokalisation innerhalb seines Wirtes. Durch Zählen einer Nematoden Bevölkerung und Scoring für bakteri…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lipid Agar (sterile)			8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution (sterile)			7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave
Egg Solution			16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth (sterile)			5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave
Microfuge	Fisher	13-100-675	Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge	Beckman	366802	Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish	Fisher	0875713
50 ml centrifuge tubes	Fisher	05-539-6
15 ml centrifuge tubes	Fisher	05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish	Fisher	0875711Z	Deeper than standard Petri dishes
24-well plate	Greiner Bio-One	662000-06
Microscope			The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (sterile)			8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes	Fisher	05-408-138	2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker			Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid	Sigma	D-1377	If needed, supplement media to a concentration or 1 mM