Protein-DNA kompleksleri Kristal yapısı, protein işlevi, etki mekanizması, aynı zamanda, belirli bir etkileşimin doğasını ilişkin bilgi sağlayabilir. Burada ile birlikte kristalleşme için uzunluk, sekans ve dupleks DNA uçları optimize etmek için rapor<em> Escherichia coli</em> SeqA, çoğaltma inisiyasyon negatif regülatörü.
Escherichia coli SeqA çoğaltma 1 kökeni olan iyon hemimethylated GAİK kümelere göre prematüre reinitiation olayları önler DNA replikasyonunun negatif düzenleyicisidir. Kökeni ötesinde, SeqA çoğaltma çatal, daha yüksek sıralı yapılarına yeni çoğaltılmış DNA düzenlemektedir 2 de bulunur. SeqA ortakları yalnızca zayıf tek GAİK dizilerine sahip, ancak birden çok GAİK siteleri içeren DNA dubleksler yüksek afinite kompleksleri oluşturur. SeqA arasında en az işlevsel ve yapısal birim böylece hemimethylated DNA 3 ile yüksek afiniteli kompleks oluşumu için en az iki GAİK dizileri ihtiyacını açıklayan bir dimer. Ayrıca, oligomerizasyonun ve esnek bir bağlayıcı ile ayrılmış DNA-bağlayıcı etki ile SeqA mimarisi, üç helisel tur kadar ayrılmış GAİK tekrarlar için bağlayıcı sağlar. Bu nedenle, bir moleküler düzeyde SeqA fonksiyonu anlama yapısal ana gerektirirSeqA parçalanma birden GAİK dizileri bağlanmıştır. Protein-DNA kristalizasyon DNA, protein ve DNA göreceli boyutları ve mimariye bağlı olarak ambalaj etkileşimleri üzerinde olağanüstü bir etkisi yok olabilir. Protein veya DNA izleri, DNA'nın çoğu daha büyük ise, kristal paketleme öncelikle protein-protein etkileşimleri aracılığı ile ortaya çıkmaktadır. Tersine, protein DNA ile aynı büyüklükte veya daha az olduğu veya sadece DNA, DNA-DNA, DNA-protein etkileşimlerinin bir kısmını kapsayan zaman kristal paketleme hakim. Bu nedenle, protein-DNA kompleksleri kristalleşme DNA uzunluğu 4 ile DNA uçları (küt çıkıntı veya) 5-7 sistematik olarak tarama gerektirir. Bu yazıda, tasarımı optimize, arındırmak ve yapı tayini için uygundur kristaller elde SeqA bir dimerik varyantı (SeqAΔ (41-59)-A25R) ile kompleks içinde tandem GAİK tekrarlar içeren hemimethylated DNA dubleksler kristalize nasıl açıklar.
Makromoleküler X-ışını kristalografisi en büyük zorluklardan biri difraksiyon kaliteli kristaller elde edilir. Protein veya protein-DNA kompleksleri halinde, bu sorun optimize edilmesi gerekmektedir ilave değişkenlere bağlı olarak daha da artmaktadır. Bu yaygın DNA uzunluğu ve yapışkan çıkıntılar varlığında daha uzun bir yarı-ana dubleks parametrelerini optimize etmek için olan komşu DNA moleküllerinin ilişki artırmak için düşünülmektedir. Bununla birlikte, bu çıkıntılar doğası ve…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar DNA saflaştırılması ile ilgili yardım için veri toplama ve Monica Pillon sırasında yardım için NSLS (Brookhaven Ulusal Laboratuvarı) da PXRR personel teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri (MOP 67189) tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
Urea | Bioshop | URE001.5 | |
40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |