Estrutura cristalina de complexos DNA-proteína pode fornecer informações sobre a função da proteína, mecanismo, assim como, a natureza da interacção específica. Aqui, nós relatamos como otimizar o comprimento, a sequência e as extremidades do DNA duplex para co-cristalização com<em> Escherichia coli</em> SEQA, um regulador negativo da iniciação da replicação.
Escherichia coli SEQA é um regulador negativo da replicação de ADN que impede eventos reinício prematuras por sequestrantes hemimethylated GATC aglomerados dentro da origem de replicação 1. Para além da origem, SEQA é encontrado nos garfos de replicação, onde organiza DNA recentemente replicado em maiores estruturas ordenadas 2. SEQA associados apenas fracamente com únicas seqüências GATC, mas forma complexos de alta afinidade com duplex de DNA contendo vários sites GATC. A unidade estrutural e funcional mínimo de SEQA é um dímero, explicando assim a exigência de pelo menos duas sequências GATC, para formar um complexo de alta afinidade com o DNA hemimethylated 3. Além disso, a arquitectura SEQA, com a oligomerização de ligação de ADN e domínios separados por um ligante flexível, permite a ligação de repetições GATC separados por até três voltas helicoidais. Portanto, a compreensão da função de SEQA em um nível molecular requer a ana estruturallise de SEQA ligada a várias sequências GATC. Na cristalização da proteína-DNA, o DNA pode ter nenhum efeito para uma excepcional sobre as interacções de embalagem, dependendo dos tamanhos relativos e da arquitectura da proteína e DNA. Se a proteína é maior do que o DNA ou pegadas maioria do DNA, o empacotamento cristalino é primariamente mediada por interacções proteína-proteína. Por outro lado, quando a proteína é do mesmo tamanho ou menor do que o DNA ou que abrange apenas uma fracção das interacções de DNA, DNA-DNA e DNA-proteína dominar empacotamento cristalino. Por conseguinte, a cristalização do DNA-proteína complexos requer o rastreio sistemático de 4 ADN de comprimento e as extremidades de ADN (sem corte ou saliência) 5-7. Neste relatório, nós descrevemos como projetar, otimizar, purificar e cristalizar duplex de DNA hemimethylated contendo repetições em tandem GATC em complexo com uma variante dimérica SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) para obter cristais adequados para a determinação da estrutura.
Um dos maiores desafios em cristalografia macromolecular de raios-X é a obtenção de cristais de qualidade de difração. No caso de complexos de proteínas ou proteína-DNA, este desafio é agravado devido às variáveis adicionais que devem ser optimizadas. Acredita-se que o comprimento do DNA e a presença de saliências pegajosas para melhorar associação de moléculas de DNA adjacentes a mais longo pseudo-duplex são os principais parâmetros para optimizar. No entanto, mostraram que a natureza e extensão…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao pessoal PXRR no NSLS (Brookhaven National Laboratory) para a assistência durante a coleta de dados e Pillon Monica para ajuda com a purificação do DNA. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP 67.189).
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
Urea | Bioshop | URE001.5 | |
40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |