Kristallstruktur von Protein-DNA-Komplexe können Einblick in Proteinfunktion, Mechanismus, sowie, die Natur der spezifischen Wechselwirkung bereitzustellen. Hier berichten wir, wie die Länge, Sequenz und Enden der DNA-Doppelstrang für Co-Kristallisation zu optimieren mit<em> Escherichia coli</em> SeqA, ein negativer Regulator der Replikation Initiation.
Escherichia coli SeqA ist ein negativer Regulator der DNA-Replikation, die vorzeitige Reinitiation Ereignisse durch Maskierungsmittel hemimethylierte GATC Cluster verhindert innerhalb der Replikationsursprung ein. Jenseits der Herkunft, wird SeqA an den Replikationsgabeln, wo es neu replizierte DNA organisiert in höhere geordneten Strukturen 2 gefunden. SeqA Mitarbeiter nur schwach mit einzelnen GATC-Sequenzen, aber es bildet eine hohe Affinität Komplexe mit DNA-Duplexe mit mehreren GATC Seiten. Die minimale funktionelle und strukturelle Einheit SeqA ein Dimer, wodurch Erläuterung der Anforderung von wenigstens zwei GATC-Sequenzen, um eine hohe Affinität Komplex mit DNA hemimethylierte 3 zu bilden. Zusätzlich erlaubt die SeqA Architektur, mit der Oligomerisierung und DNA-bindenden Domänen durch einen flexiblen Linker getrennt sind, die Bindung an GATC Repeats durch bis zu drei Wendelgänge getrennt. Daher Verständnis der Funktion SeqA auf molekularer Ebene erfordert die strukturelle anaLyse SeqA mehrere GATC Sequenzen gebunden. In Protein-DNA Kristallisation kann DNA keine haben eine außergewöhnliche Wirkung auf die Verpackung Wechselwirkungen in Abhängigkeit von den relativen Größen und Architektur des Proteins und der DNA. Wenn das Protein größer ist als die DNA oder Fußabdrücke meisten der DNA wird die Kristallpackung primär durch Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt. Umgekehrt, wenn das Protein die gleiche Größe oder kleiner als der DNA ist, oder es deckt nur einen Teil der DNA-, DNA-DNA-und DNA-Protein-Wechselwirkungen Kristallpackung dominieren. Daher erfordert Kristallisation von Protein-DNA-Komplexe die systematische Screening von DNA-Länge 4 und DNA-Enden (blunt oder Überhang) 5-7. In diesem Bericht beschreiben wir, wie zu entwerfen, zu optimieren, zu reinigen und zu kristallisieren hemimethylierte DNA-Duplexe mit Tandem-GATC Wiederholungen im Komplex mit einem dimeren Variante SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R), um geeignete Kristalle für die Strukturaufklärung erhalten.
Eine der größten Herausforderungen in der makromolekularen Röntgenkristallographie ist der Erhalt Beugungsqualität Kristalle. Im Falle von Protein-oder Protein-DNA-Komplexe, wird diese Herausforderung verschärft durch die zusätzlichen Variablen optimiert werden müssen. Es wird allgemein angenommen, dass die Länge der DNA und die Anwesenheit von klebrigen Überhänge zur Vereinigung von benachbarten DNA-Moleküle in einer längeren Pseudo-Duplex werden die wesentlichen Parameter zur Optimierung verbessern. Wir ha…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die PXRR Mitarbeiter an der NSLS (Brookhaven National Laboratory) danken für die Unterstützung während der Datensammlung und Monica Pillon für die Hilfe bei DNA-Aufreinigung. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (MOP 67.189) unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
Urea | Bioshop | URE001.5 | |
40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |