Validación de alto rendimiento de candidatos a biomarcadores múltiples pueden ser realizadas por ELISA secuencial con el fin de minimizar ciclos descongelación / congelación y el uso de muestras de plasma preciosos. Aquí nos muestran cómo realizar secuencialmente ELISAs para seis diferentes biomarcadores plasmáticos validados<sup> 1-3</sup> De la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD)<sup> 4</sup> En la misma muestra de plasma.
Recomendaciones proteómica estrategias de descubrimiento tiene el potencial de identificar un gran número de nuevos biomarcadores que pueden mejorar las pruebas de diagnóstico y pronóstico en un entorno clínico y puede ayudar a dirigir intervenciones terapéuticas. Cuando grandes cantidades de las proteínas candidatas se identifican, puede ser difícil validar biomarcadores candidatos de una manera oportuna y eficiente a partir de muestras de plasma de pacientes que están controladas por evento, de volumen finito e irremplazable, como en el inicio de aguda de injerto contra huésped (EICH) es una complicación potencialmente mortal de alogénico de células madre hematopoyéticas (TCMH).
Aquí se describe el proceso de realización de pruebas ELISA disponibles comercialmente para seis proteínas validados GVHD: IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, y REG3α 3 (también conocido como PAP1) de una manera secuencial para minimizar ciclos de congelación-descongelación, Se descongeló plasma, tiempo y uso de plasma. Para este procedimiento se lleve a cabo los ensayos ELISA en orden secuencial según lo determinado por el factor de dilución de la muestra según lo establecido en nuestro laboratorio utilizando kits de ELISA fabricante y protocolos con ajustes menores para facilitar un rendimiento óptimo secuencial ELISA. Las concentraciones plasmáticas resultantes de biomarcadores puede ser recopilada y analizada por los hallazgos significativos dentro de una cohorte de pacientes. Si bien estos biomarcadores son actualmente para fines de investigación, su incorporación a la atención clínica está siendo investigado actualmente en ensayos clínicos.
Esta técnica se puede aplicar para llevar a cabo pruebas ELISA para múltiples proteínas / citoquinas de interés en la misma muestra (s) siempre que las muestras no necesitan ser mezclados con otros reactivos. Si kits de ELISA no vienen con pre-recubiertos con placas, placas de 96 pocillos medio pocillos o placas de 384-y se puede utilizar para minimizar aún más el uso de muestras / reactivos.
Aguda de injerto contra huésped (EICH), una de las principales causas de mortalidad sin recaídas (NRM) después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (TCMH), se mide por la disfunción en tres sistemas orgánicos: la piel, el hígado y tracto gastrointestinal (GI) tracto 4. La EICH aguda se produce normalmente entre dos y ocho semanas después del trasplante, pero puede ocurrir más tarde, y con frecuencia es clínicamente indistinguible de otras complicaciones post-TPH como la toxicidad acondicionado régimen, infección o efectos secundarios de la medicación. Mediante el uso de las estrategias proteómicas y validación de alto rendimiento utilizando secuencial ELISA, se han identificado 6 proteínas cuyas concentraciones son elevadas en la aparición de las manifestaciones clínicas de la GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF y IL 8-, cuando se combinan en un panel de 4-biomarcador puede diagnosticar la GVHD en el inicio de los síntomas clínicos y puede predecir la supervivencia después de un TCMH independientemente de la gravedad de GVHD 1. Elafin, un biomarcador de GVHD de la skin, puede discriminar entre erupción y erupción GVHD por otras causas, tales como erupciones medicamentosas y puede predecir la supervivencia del trasplante 2. Recientemente hemos identificado REG3α como un biomarcador de la EICH del tracto gastrointestinal inferior, el órgano diana que más se asocia con el MRN. La concentración plasmática de REG3α puede identificar con fiabilidad la EICH como la causa de la diarrea post-TPH y se correlacionan con la severidad histológica de la GVHD en diagnóstico biopsias intestinales. Concentraciones REG3α en GI inicio GVHD también puede predecir la respuesta al tratamiento y manejo de recursos naturales GVHD 3. La incorporación de estos biomarcadores validados GVHD en la atención clínica está siendo investigado actualmente en ensayos clínicos.
Estos experimentos se realizaron en alícuotas de plasma pequeñas tomadas de pacientes que recibieron TPH entre 2000 y 2010 en el momento de inicio de GVHD que son insustituibles y de cantidad limitada. Debido a la naturaleza valiosa de estas muestras, se ha desarrollado un metHod de medición de múltiples concentraciones de proteínas plasmáticas de una manera eficiente y reproducible para eliminar el exceso de congelación y descongelación, el tiempo de descongelación y el uso de plasma. Esta técnica se puede aplicar para llevar a cabo pruebas ELISA para múltiples proteínas / citoquinas de interés en la misma muestra (s) siempre que las muestras no necesitan ser mezclados con otros reactivos. Si kits de ELISA no vienen con pre-recubiertos con placas, placas de 96 pocillos medio pocillos o placas de 384-y se puede utilizar para minimizar aún más el uso de muestras / reactivos. Este manuscrito se centra en los aspectos tecnológicos de la medición de biomarcadores GVHD.
El método secuencial ELISA que aquí se presenta permite la medición de las proteínas plasmáticas en múltiples pequeños volúmenes de plasma que pueden ser difíciles de obtener y / o irremplazables tales como muestras de sujetos humanos con enfermedades raras o muestras de plasma obtenidas de ratones 9,10. Los ELISAs secuenciales se realizan típicamente en el orden del factor de aumento de dilución de plasma, con ELISAs requieren plasma diluido 1:10 ≥ típicamente no pueda ser recuperado, aunque esto puede hacerse si se desea. La capacidad de realizar secuencial ELISA está limitada por kits de ELISA / protocolos en los que se mezcla el plasma con otros reactivos o para el que diferentes tampones de dilución se requieren para el plasma, lo que se opone a la ablility volver a utilizar una muestra debido a preocupaciones de que una incompatibles tampón / reactivo interfiere con la realización de una prueba particular. Con una planificación cuidadosa, 10 o más pruebas ELISA puede realizarse de la misma muestra de plasma.
Ent "> laboratorios individuales pueden necesitar ajustar diluciones de plasma con el fin de tener resultados interpretables en base a las concentraciones plasmáticas esperadas de la proteína de interés en las muestras de los sujetos de prueba. Las diferencias en equipos de laboratorio puede resultar en la necesidad de optimizar la incubación y el desarrollo colorimétrico veces, el número de lavados y / o lavar tiempos de inmersión con el fin de optimizar cualquier dado ELISA.Para aumentar la capacidad de alto rendimiento y precisión y para realizar análisis de una manera rentable, el uso de una plataforma de manipulación robótica líquido capaz de análisis en placas de 384 pocillos y un lavador de placas automatizado con unidad de apilamiento se recomiendan. Este equipo puede aumentar la exactitud y precisión del análisis realizado por múltiples usuarios, y ayudar a garantizar la coherencia de análisis para reducir inter-e intra-ensayo de variación.
Se utilizó ELISA secuencial sobre plataformas múltiplex disponibles, por dos razones: 1) La mayoría de laspares de anticuerpos para proteínas nuevas no puede fácilmente ser conjugados en perlas o de otros materiales, así como tiempo y es costoso, 2) individuales de los ensayos ELISA son más precisos que los microarrays multiplex o perlas, secundaria a una ausencia de reactividad cruzada 11. Si un método fiable se establece para realizar multiplexados, basado en perlas microarrays, puede ser capaz de reemplazar el proceso secuencial de ELISA, pero puede estar limitado por la capacidad para conjugar los anticuerpos a perlas y / o por el número de proteínas deseadas a ser analizado.
The authors have nothing to disclose.
Apoyado por el NIH subvenciones RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, la Fundación Hartwell, y la Fundación Caritativa Doris Duke. Dr. Paczesny es un investigador del fondo Eric Hartwell y el Programa de Investigación Amy Strelzer Manasevit.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |