Convalida elevato throughput di biomarcatori candidati multipli può essere eseguita da ELISA sequenziale per minimizzare gelo / disgelo e l'uso di campioni di plasma preziosi. Qui, dimostriamo come eseguire in sequenza ELISA per sei diversi biomarcatori plasmatici convalidati<sup> 1-3</sup> Di graft-versus-host disease (GVHD)<sup> 4</sup> Il campione di plasma stesso.
Consigli proteomica scoperta strategie hanno la possibilità di identificare un gran numero di nuovi biomarker in grado di migliorare i test diagnostici e prognostici in ambito clinico e può aiutare a interventi terapeutici guida. Se la quantità di proteine candidate sono identificati, può essere difficile per validare biomarcatori candidati in modo tempestivo ed efficace da campioni di plasma di pazienti che sono event-driven, di volume finito e insostituibili, come all'inizio della acute graft-versus- host disease (GVHD), una complicazione potenzialmente pericolosa per la vita del trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT).
Qui si descrive il processo di esecuzione ELISA commercialmente disponibili per sei proteine convalidati GVHD: IL-2Rα 5, TNFR1 6, 7 HGF, IL-8 8, elafin 2, e REG3α 3 (noto anche come PAP1) in modo sequenziale per minimizzare cicli gelo-disgelo, Scongelati plasma nel tempo e l'utilizzo di plasma. Per questa procedura si eseguire i test ELISA in ordine sequenziale come determinato dal fattore di diluizione del campione, come stabilito nel nostro laboratorio utilizzando quelle kit ELISA e protocolli con piccole modifiche per facilitare ottimali prestazioni sequenziali ELISA. I risultanti concentrazioni plasmatiche di biomarker possono essere raccolti e analizzati per i dati significativi emersi all'interno di una coorte di pazienti. Mentre questi biomarcatori sono attualmente per scopi di ricerca, il loro inserimento nella cura clinica è attualmente in fase di studio in studi clinici.
Questa tecnica può essere applicata per eseguire saggi ELISA per proteine / citochine multiple di interesse sullo stesso campione (s) fornito i campioni non devono essere miscelati con altri reagenti. Se kit ELISA non sono dotati di pre-rivestite piastre a 96 pozzetti mezzo pozzetti o 384 pozzetti può essere utilizzato per ridurre ulteriormente l'uso di campioni / reagenti.
Acute graft-versus-host disease (GVHD), una delle principali cause di mortalità senza ricadute (NRM) dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT), viene misurata da una disfunzione in tre organi: la pelle, il fegato e gastrointestinali (GI) tratto 4. GVHD acuta si verifica in genere tra due e otto settimane dopo il trapianto, ma si può verificare in seguito, e spesso è clinicamente indistinguibile da altre post-HSCT complicanze quali la tossicità regime di condizionamento, infezioni o effetti collaterali dei farmaci. Attraverso l'uso di strategie di proteomica e di high-throughput di convalida utilizzando sequenziale ELISA, abbiamo identificato 6 proteine la cui concentrazione sono elevate al momento della comparsa di manifestazioni cliniche di GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF e IL-8, quando combinati in un 4-biomarker pannello può diagnosticare GVHD al momento della comparsa dei sintomi clinici e può prevedere post-trapianto sopravvivenza indipendentemente gravità GVHD 1. Elafin, un biomarker per GVHD della skin, in grado di discriminare tra eruzione GVHD e rash da altre cause, come eruzioni da farmaci e possono predire la sopravvivenza dei trapianti 2. Abbiamo recentemente identificato REG3α come biomarker di GVHD del tratto gastrointestinale inferiore, l'organo bersaglio più associato con NRM. La concentrazione plasmatica di REG3α può identificare in modo affidabile GVHD come la causa per il post-trapianto diarrea e correlati alla gravità istologica di GVHD in diagnostici biopsie intestinali. Concentrazioni REG3α all'esordio GI GVHD può anche prevedere la risposta alla terapia e GVHD NRM 3. L'integrazione di questi biomarcatori convalidati GVHD in cura clinica è attualmente in fase di studio in studi clinici.
Questi esperimenti sono stati eseguiti su piccole aliquote di plasma raccolti da pazienti sottoposti a trapianto tra il 2000 e il 2010, al momento di insorgenza GVHD che sono insostituibili e di quantità limitata. A causa della natura preziosa di questi campioni, abbiamo sviluppato un method di misurare concentrazioni di proteine plasmatiche più in modo efficiente e riproducibile per eliminare eccesso di cicli gelo-disgelo, il tempo di scongelamento e l'utilizzo del plasma. Questa tecnica può essere applicata per eseguire saggi ELISA per proteine / citochine multiple di interesse sullo stesso campione (s) fornito i campioni non devono essere miscelati con altri reagenti. Se kit ELISA non sono dotati di pre-rivestite piastre a 96 pozzetti mezzo pozzetti o 384 pozzetti può essere utilizzato per ridurre ulteriormente l'uso di campioni / reagenti. Questo manoscritto si concentra sugli aspetti tecnologici di misurazione biomarcatori GVHD.
Il metodo sequenziale ELISA qui presentato consente la misurazione delle proteine plasmatiche multiple su piccoli volumi di plasma che possono essere difficili da ottenere e / o insostituibili come campioni di soggetti umani con malattie rare o campioni di plasma ottenuti da topi 9,10. I test ELISA sequenziali sono tipicamente eseguite nell'ordine del fattore di diluizione del plasma aumentando, con ELISA richiedono plasma diluito ≥ 1:10 tipicamente non dover essere recuperato, anche se questo può essere fatto se desiderato. La possibilità di eseguire sequenziale ELISA è limitato dal kit ELISA / protocolli in cui si mischia il plasma con altri reagenti o per i quali tamponi diluizioni differenti sono necessari per il plasma, il che esclude la ablility di riutilizzare un campione a causa delle preoccupazioni che un incompatibili buffer / reagente interferire con le prestazioni di un determinato test. Un'attenta progettazione, 10 o più metodica ELISA può essere eseguita sul campione di plasma stesso.
ENT "> I singoli laboratori potrebbe essere necessario regolare diluizioni del plasma al fine di ottenere risultati interpretabili basati sulla concentrazione plasmatica attesi della proteina di interesse nei campioni da parte dei soggetti di prova. differenze di attrezzature di laboratorio può comportare la necessità di ottimizzare l'incubazione e lo sviluppo colorimetrico volte, numero di lavaggi e / o lavare ammollo volte al fine di ottimizzare qualsiasi dato ELISA.Per aumentare alta produttività e precisione e capacità di effettuare analisi in un modo economicamente vantaggioso, l'uso di una piattaforma di movimentazione robotica liquido capace di analisi su piastre a 384 pozzetti ed un lavatore automatico con unità di impilaggio sono raccomandati. Questo apparecchio può aumentare l'accuratezza e la precisione di analisi eseguite da più utenti, e contribuire a garantire la coerenza di analisi per ridurre le inter-e intra-saggio di variazione.
Abbiamo usato sequenziale ELISA su piattaforme multiplex disponibili per due motivi: 1) La maggior parte dellecoppie di anticorpi per nuove proteine non possono essere facilmente essere coniugati in perline o altro materiale così come lunga e costosa, 2) i singoli test ELISA sono più precisi di microarray multiplex o perline, secondaria ad una assenza di reattività crociata 11. Se un metodo affidabile viene stabilita effettuare multiplexati, bead-based microarrays, può essere in grado di sostituire il processo sequenziale ELISA, ma può essere limitata dalla capacità di coniugare gli anticorpi per perline e / o dal numero di proteine desiderate essere analizzato.
The authors have nothing to disclose.
Supportato da sovvenzioni NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, la Fondazione Hartwell, e la Fondazione Doris Duke Charitable. Dr. Paczesny è un investigatore della Hartwell Eric fondo e il programma di ricerca Amy Strelzer Manasevit.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |