여러 후보 생체의 높은 처리량 검증은 동결 / 해동 사이클을 최소화하고 귀중한 플라즈마 샘플을 사용하기 위해 순차적 엘리사에 의해 수행 할 수 있습니다. 여기, 우리는 순차적으로 여섯 가지 검증 플라즈마 생체에 대한 ELISAs을 수행하는 방법을 보여줍니다<sup> 1-3</sup> 이식 – 대 – 호스트 질환 (GVHD)의<sup> 4</sup> 동일한 플라즈마 샘플 있습니다.
편견 발견 단백질 체학 전략은 임상 환경에서 진단 및 전조 테스트를 개선 할 수 있으며, 가이드 치료 개입에 도움이 될 수 있습니다 새로운 생체 많은 수의을 식별 할 수있는 가능성이 있습니다. 후보 단백질의 큰 번호가 식별되면, 이러한 급성 발병시와 같은 유한 볼륨, 이벤트 중심과 바꾸어 놓을 수없는 아르 환자 플라즈마 샘플에서 신속하고 효율적인 방식으로 후보 생체를 확인하기 어려울 수 있습니다 그래프트 – 대 – 호스트 질환 (GVHD), allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)의 잠재적 생명을 위협하는 합병증.
최소화하기 위해 순차적 방식으로 IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8 elafin 2, REG3α 3 (도 PAP1라고도 함) : 여기 여섯 확인 GVHD 단백질에 대한 상업적으로 이용 가능한 ELISAs을 수행하는 과정을 설명 동결 – 해동 사이클, 플라즈마 시간 및 플라즈마 사용을 해동. 최적의 연속 엘리사의 성능을 촉진하기 사소한 조정으로 제조업체 엘리사 키트 및 프로토콜을 사용하여 저희 연구실 년에 설립 된로 샘플 희석 요인에 의해 결정이 절차를 들면 우리는 순서대로 ELISAs을 수행합니다. 그 결과 플라즈마 biomarker 농도 그런 다음 컴파일하고 환자 일대에서 상당한 결과를 분석 할 수 있습니다. 이러한 생체는 연구 목적으로 현재 있지만, 임상 치료에의 설립은 현재 임상 시험에서 조사되고있다.
이 기술은 (들)은 다른 시약과 혼합 할 필요가 없습니다 샘플을 제공 같은 샘플에서 여러 단백질 / 관심 크린 시토 킨에 대한 ELISAs을 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다. 엘리사 키트는 사전 코팅 플레이트, 96도 반 잘 플레이트 또는 384 잘 접시와 함께 제공되지 않을 경우 자세한 샘플 / 시약의 사용을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다.
급성 이식 – 대 – 호스트 질환 (GVHD), allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 후 비 재발 사망률 (NRM)의 주요 원인은 3 장기 시스템의 장애에 의해 측정된다 : 피부, 간, 위장 (GI) 기관 4. 급성 GVHD는 일반적으로 두 사람 사이와 팔주 이식 후 발생하지만 나중에 발생할 수 있으며, 종종 조절 처방 독성, 감염이나 약물의 부작용 등의 사후 HSCT 합병증의 임상 구분할 수 있습니다. 연속 엘리사를 사용하여 proteomic 전략과 높은 처리량 검증의 사용을 통해, 우리는 누구의 농도 GVHD의 임상 발현의 발병에 수치가 올라 6 단백질을 확인했습니다. 4 biomarker 패널로 결합 IL-2Rα, TNFR1, HGF와 IL-8은 임상 증상의 발병에 GVHD 진단 할 수 있으며 독립적으로 GVHD 심각도 1 포스트 HSCT 생존을 예측할 수 있습니다. Elafin, SK의 GVHD를위한 biomarker에서, 약물 폭발과 같은 다른 원인에서 GVHD 발진과 발진을 구별 할 수 있으며 이식 생존 2 예측할 수 있습니다. 우리는 최근에 낮은 위장관의 GVHD의 biomarker로 REG3α 확인했습니다, 표적 장기는 대부분의 NRM과 관련된. 플라즈마 REG3α 농도가 안정적 후 HSCT 설사의 원인으로 GVHD 파악하고 진단 장 biopsies에 GVHD의 histologic 정도 상관 관계를 할 수 있습니다. GI GVHD의 발병에 REG3α 농도는 GVHD 치료와 NRM 3 응답을 예측 할 수 있습니다. 임상 치료에 이러한 검증 GVHD 생체의 결합은 현재 임상 시험에서 조사되고있다.
이 실험은 바꾸어 놓을 수없는 제한된 수량의 아르 GVHD 발병시 2000 년과 2010 사이에 HSCT를받은 환자에서 수집 한 작은 플라즈마 aliquots에서 수행되었다. 이 샘플의 고귀한 특성으로 인해, 우리는 만난을 개발했습니다초과 동결 – 해동 사이클, 해동 시간과 플라즈마의 사용을 제거 할 수있는 효율적 재현 방식으로 여러 혈장 단백질의 농도를 측정 석탄 통. 이 기술은 (들)은 다른 시약과 혼합 할 필요가 없습니다 샘플을 제공 같은 샘플에서 여러 단백질 / 관심 크린 시토 킨에 대한 ELISAs을 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다. 엘리사 키트는 사전 코팅 플레이트, 96도 반 잘 플레이트 또는 384 잘 접시와 함께 제공되지 않을 경우 자세한 샘플 / 시약의 사용을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 GVHD 생체 측정의 기술적 측면에 초점을 맞추고 있습니다.
여기에 제시된 순서 엘리사 방법은 마우스 9,10에서 얻은 희귀 한 질병 또는 플라즈마 샘플과 인간의 과목에서 샘플로 바꾸어 놓을 수없는 취득 및 / 또는하기 어려울 수도 플라즈마의 작은 볼륨에 여러 혈장 단백질의 측정 할 수 있습니다. 연속 ELISAs는 일반적으로 필요로하는 ELISAs으로 증가 플라즈마 희석 계수의 순서로 수행 플라즈마 희석 ≥ 일반적으로 원하는 경우이 작업을 수행 할 수 있지만, 복원 할 필요가 없습니다 1시 10분 않고 있습니다. 연속 엘리사을 수행 할 수있는 능력은 플라즈마 다른 시약과 혼합되어 있거나하는 다른 희석 버퍼가 플라즈마에 필요한되는 엘리사 키트 / 프로토콜에 의해 제한되며이 다시 사용할 수있는 샘플로 인해 해당 호환되지 않는 문제에 ablility을 precludes 버퍼 / 시약은 특정 테스트의 성능에 영향을 것입니다. 신중한 계획을 통해 10 명 이상 ELISAs은 같은 플라즈마 샘플에서 수행 할 수 있습니다.
다닐 "> 개인 실험실 시험 과목에서 샘플에 대한 관심의 단백질의 예상 플라즈마 농도에 따라 interpretable 결과를하기 위해 플라즈마 dilutions을 조정해야 할 수도 있습니다. 실험실 장비의 차이는 부화와 colorimetric 개발을 최적화 할 필요가 될 수 있습니다 시간, 세차의 수 및 / 또는 세탁은 특정 엘리사을 최적화하기 위해 시간을 즐겨보십시오.높은 처리량 용량과 정확성을 향상하고 비용 효율적인 방식으로 분석을 수행하기 위해 384 잘 접시에 분석 및 스태킹 장치와 자동 플레이트 와셔 할 수있는 로봇 액체 처리 플랫폼의 사용을 권장합니다. 이 장비는 여러 사용자에 의해 수행 분석의 정확성과 정밀도를 향상, 간 및 간 분석 편차를 줄이기 위해 분석의 일관성을 제공하는 데 도움이됩니다.
1)의 대부분을 : 우리는 두 가지 이유에 사용할 멀티 플랫폼을 통해 순차적 엘리사를 사용소설 단백질에 대한 항체 쌍 쉽게 구슬 또는 기타 자료에 복합뿐만 아니라 시간이 많이 걸릴 비싼 수 없습니다, 2) 각 엘리사의 assays 간 반응성 11 부재에 보조 멀티 플렉스 microarray 또는 구슬,보다 더 정확한 있습니다. 신뢰할 수있는 방법은 멀티 플렉스, 구슬 기반 microarrays를 수행하기 위해 설립되어있는 경우,이 순서 엘리사 과정을 대체 할 수 수 있지만, 구슬 및 /에 항체를 결합한 할 수있는 능력이나 할 원하는 단백질의 수에 의해 제한 될 수 있습니다 분석했다.
The authors have nothing to disclose.
NIH 보조금 RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, Hartwell 재단, 그리고 도리스 듀크 자선 재단 지원. 박사 Paczesny은 에릭 Hartwell 기금과 에이미 Strelzer Manasevit 연구 프로그램의 수사관이다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |