Una visión general del protocolo se presenta en la Figura 1. Biología Molecular 1. Construir Diseño Utilice el software Compositor Gene para diseñar construcción de la proteína y el codón de ingeniería secuencias de genes sintéticos. El uso de software Compositor Gene ha sido ofrecido en detalle en otra parte 3. Utilice el módulo Visor de Alineación y Construcción de Módulo de Diseño para comparar secuencias de proteínas alineaciones y definir construcción de la proteína. Alinear la secuencia de aminoácidos diana a ambos los elementos estructurales primarios y 3D de homólogos en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), si está disponible (Figura 2). Utilizar la información de alineación para hacer diseños constructo estructura-guiadas por la elección de nuevos terminales basados en la conservación de la estructura primaria y estructuras 3D de homólogos. Diseño de PCR inserto (iPCR) y el vector PCR (vPCR) amplímeros (terminal de cebadores). Usando Gene Calgoritmo de proteína-ADN de omposer, de vuelta-traducir la secuencia de aminoácidos constructo en secuencia de ácido nucleico de ingeniería codón. Utilice la tabla de uso de codones adecuada (CUT) para optimizar la secuencia para la expresión en E. coli. Prácticamente clonar inserción en pET28 vector modificado para incorporar una etiqueta N-terminal histidina 6x y proteína de fusión Smt3/SUMO que permite una fácil purificación. Poner fin gen sintético con DNA 2.0 y cebadores orden de Integrated DNA Technologies. 2. Polimerasa incompleta Extensión Clonación Primer (PIPE) Prepare Primers y Genes Centrifugar las placas suministrados por el proveedor que contienen cebadores a 1.000 rpm durante 1 min. Traiga primer concentración de 100 mM y añadir tampón TE 50 l. Diluir cebadores a 10 mM con agua desionizada (DI) en una placa de fondo en v de 96 pocillos. Centrifugar el gen suministrado por el proveedor en un tubo de 1,5 ml a 1300 rpm durante 1 min. <li> Uso de tampón TE, llevar la concentración de ADN de cada tubo a 50 ng / l. En tubos de 1,5 ml, hacer diluciones de cada cebador a 10 ng / l. Primers Tienda y genes a -20 ° C cuando no esté en uso. Prepare Insertar PCR (iPCR) Descongelar un vial de Pfu Master Mix en hielo; mantener los genes y los cebadores a temperatura ambiente. Crear un mapa de asignación de los pozos de la placa a un conjunto de cebadores y construir. Añadir 13 l de agua DI en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Añadir 5 l de hacia adelante y 5 l de cebador inverso a cada reacción en la placa de 96 pocillos de acuerdo con el mapa placa, asegurando a cambiar las puntas entre cada pocillo. Añadir 2 l de cada gen de longitud completa para su adecuada bien según el mapa de la placa. Añadir 25 l de Pfu maestro de la mezcla a cada pocillo, asegurando a cambiar las puntas entre cada pocillo. Ciclo de las reacciones con las siguientes condiciones de PCR: 95 ° C 2 min </li> 95 ° C 30 seg 50 ° C 45 seg 68 ° C 3 min 4 ° C ∞ Repita los pasos bd durante 25 ciclos. Transferir 10 l de cada reacción iPCR a una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Añadir 3 l de colorante de carga 6X a cada muestra. Separar cada muestra en un gel de 1% de agarosa TAE EtBr a 110 V al lado de una escalera de 100-500 pb de ADN para confirmar la amplificación de fragmentos. Tienda producto iPCR a -20 ° C cuando no está en uso (evitar la congelación descongelación tanto como sea posible). 3. Preparar vectorial PCR (vPCR) Iniciar cultivo nocturno de E. transformado coli con el plásmido vector pET28. Inocular dos tubos de 5 ml de caldo de 2-YT con 50 mg / ml de kanamicina. Los cultivos durante la noche a 37 ° C en el agitador a 220 rpm. Centrifugar las culturas después de una noche de crecimiento por centrifugación a 3000 rpm durante 15 min. Utilice un Qiagen QIApreparación Spin Miniprep Kit para extraer vector pET28 de sedimentos bacterianos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Configuración de digestiones con enzimas de restricción del plásmido pET28 extrajeron. Añadir 2,2 l de tampón BamHI 10X y 1 l de BamHI y HindIII para 20 l de vector pET28. Se incuba la reacción durante 1 hora a 37 ° C. Producto de digestión separada en un gel. Consulte el paso 2.2.10. Cortar banda del vector a partir de gel y se purifica utilizando el kit de extracción de gel QIAquick según las instrucciones del fabricante. El uso de un NanoDrop, cuantificar la concentración de ADN. Diluir corte vector de 10 ng / l. Almacenar a -20 ° C cuando no esté en uso. Prepare primers vPCR. Centrifugar IDT oligonucliotides suministrados durante 1 minuto a 1300 rpm. Traiga la concentración de 100 mM con agua DI. Preparar una dilución 10 mM de ambos adelante y atrás en un tubo de 1,5 ml. Tienda cebadores y las diluciones de imprimación a -20 ° C. Descongelar Pfu Master Mix en molde y los cebadores de hielo y la descongelación a temperatura ambiente. Reacciones vPCR instalación de una placa de PCR de 96 pocillos: En la primera fila de una placa de 96 pocillos se combinan 60 l de ambos cebadores directo e inverso vPCR y 24 l de pET28 digerido plantilla (10 ng / l). Usando una pipeta multicanal 12 de punta, la transferencia de 12 l de la imprimación y la mezcla maestra a cada plantilla restante pocillo de la placa. Esto debe resultar en 12 l de cebador y la plantilla de mezcla maestra en cada pocillo de la placa. Añadir 13 l de agua DI a cada pocillo. Añadir 25 l de Pfu Master Mix en cada pocillo. Ciclo de las reacciones a través de las condiciones de PCR utilizadas en el paso 2.2.7. Piscina todas las reacciones vPCR en un tubo de 15 ml Falcon. Verifique amplificación de fragmentos separando 10 l de producto de PCR agrupado en un gel (duración prevista de vector digerido pET28es de aproximadamente 6 kb). Consulte el paso 2.2.10. Prepare combinar platos. Alícuota 3 l de producto vPCR en cada pocillo de una placa de fondo en v de 96 pocillos. Placas Almacenar a -20 ° C hasta merge con el producto iPCR. 4. Combinar iPCR y vPCR Productos Productos iPCR Descongelar y pre-vPCR alícuota de 96 pocillos se unen la placa a temperatura ambiente. Añadir 3 l de cada producto iPCR a su respectivo pocillo de la placa de mezcla. Transformar fusionar placa en Top Ten células químicamente competentes. Añadir 2 l de cada reacción se funden en un solo tubo de 50 l de células químicamente competentes suministrado por el proveedor y proceda con el protocolo suministrado por el fabricante. Preparar cultivos de una noche para cada construcción de la placa de la transformación. Alícuota de 5 ml de caldo de TB (con 50 g / ml de kanamicina) a partir de un depósito de 25 ml estéril en cada pocillo de un bloque de pozo profundo. Usando sterile técnica, elige una colonia aislada de cada placa de transformación e inocular el pozo correspondiente del bloque de pozo profundo. Cubra el bloque con una cubierta Airpore. Agitar bloque a 220 rpm a 37 ° C durante la noche. Precipitar las células por centrifugación del bloque durante 30 min a 4000 rpm. Retirar el sobrenadante y acariciar la parte superior del bloque de secar con una toalla de papel. Mini-Prep utilizando un Qiagen de 96 pocillos aparato de vacío de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 5. Preparación de Acciones de glicerol de construcciones con éxito clonados Transform clonado con éxito secuencia de ADN validado en BL21 (DE3) células químicamente competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada constructo, recoger una sola colonia aislada de la (DE3) transformación e inocular BL21 en 1 ml de caldo de 2-YT (con 50 g / ml de kanamicina). Agite culturas a 220 rpm durante 3-4 horas a 37 ° C. Etiquetar un 1,5 mlenroscar la tapa del tubo con el número único de identificación de constructo, cepa de células, y la fecha. Añadir 500 l de glicerol al 50% y 500 l de cultivo celular y se invierte varias veces. Inmediatamente almacenar de glicerol en hielo seco o en un congelador a -80 ° C. 6. Pruebas de Expresión Lisis Buffe r Tampón de lavado Tampón de elución 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM de NaCl 10 mM de imidazol 1% de Tween 20 2 mM MgCl 2 0,1 l / ml de Benzonase 1 mg / ml de lisozima 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM de NaCl 20 mM de imidazol 0,05% de Tween 20 25 mM de Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl 250 mM de imidazol 0,05% de Tween 20 * Añadir Benzonase, lisozima,y el inhibidor de la proteasa inmediatamente antes de la lisis. Racha de una muestra de glicerol en agar selectivo kanamicina y se incuba durante la noche a 37 ° C. Iniciar un pre-cultivo no induce en un bloque de 96 pocillos de fondo redondo; inocular 1,2 ml de caldo de TB (con 50 mg / ml de kanamicina) suplementado con 0,5% de glucosa con una E. recién crecido aislar coli. Crecer durante la noche con agitación a 220 rpm a 37 ° C. Después de un crecimiento durante la noche, iniciar cultivos de inducción mediante la inoculación de 1,2 ml de caldo de TB (con 50 mg / ml de kanamicina) suplementado con Novagen noche a la mañana Sistema Express 1 (de acuerdo con el protocolo del fabricante) con 40 l de la pre-cultivo. Cultivar las culturas de inducción pequeña escala a 20 ° C durante 48 horas, agitando a 220 rpm. Células de la cosecha por centrifugación a 4000 rpm durante 15 min, se vierte el sobrenadante y se almacena a -20 ° C durante al menos 1 hora antes de la elaboración. En el bloque de 96 pocillos, volver a suspender los sedimentos de células en 300 l de tampón de lisis. </li> Se incuban las células en tampón de lisis a temperatura ambiente durante 30 min seguido por lisis mecánica agitando vigorosamente durante 30 min a temperatura ambiente. Aclarar el lisado crudo por centrifugación durante 30 min a 4000 rpm a 4 ° C. Utilizar una pipeta de múltiples canales para transferir 200 l del lisado clarificado (fracción soluble) a una bandeja de 96 pocillos de fondo plano (Qiagen). Para cada pocillo que contiene una muestra, añadir 40 perlas de Ni-NTA magnéticos l (Qiagen). Agitar suavemente la placa en un agitador durante 1 hora a 16 ° C. Colocar la placa en una placa posterior magnética (Qiagen) y retirar la fracción soluble no unido. Tenga cuidado de no pipeta a cabo cualquiera de las perlas de Ni-NTA. Retirar la placa de la placa posterior y se resuspendieron suavemente las perlas en 200 l de tampón de lavado. Pipetear hacia arriba y abajo durante 30 segundos y luego colocar la placa posterior de la placa posterior. Retirar el tampón de lavado y repita el paso 6.12. Retire la placa de la placa posterior y eluir el Ni-NTA obligado taproteína rget por lavado con 50 l de tampón de elución durante 5 min. Volver placa de fondo plano a la placa de poste magnético y transferir la elución a una placa de fondo en v de 96 pocillos fresca. Transferir 20 l de la elución a una placa de fondo en v de 96 pocillos fresca y reaccionar con 1 l Ulp1 proteasa. De acuerdo con el protocolo del fabricante, analizar la fracción eluida y se eluyó + Ulp1 por electroforesis capilar utilizando un LabChip 90. Alternativamente, todas las fracciones de la prueba de expresión pueden ser analizados a través de SDS-PAGE. 7. Grande fermentación a escala Utilizar una punta de pipeta estéril para obtener una raspadura de un stock de glicerol, inocular 100 ml de caldo de TB (con 50 mg / ml de kanamicina) y crecer durante la noche. Agitar a 220 rpm y 37 º C. Después de un crecimiento durante la noche, ampliar de pre-cultivo mediante la inoculación de 1 L de caldo TB con soluciones autoinducción EMD (véase el protocolo del fabricante) (con 50 mg / ml de kanamicina) en un matraz de 2 L desconcertado con 10 ml de lapre-cultivo (dilución 1:100). Agitar los cultivos expandidos 1 L a 37 ° C; cambiar la temperatura de la incubadora de agitación a 20 ° C cuando se alcanza una densidad óptica de 0,6 (OD 600). Después del crecimiento durante la noche, tener un representante alícuota de 10 ml de cada construcción para las pruebas de expresión. Cosecha de células pegar por centrifugación a 5000 rpm durante 15 min y se descartó el sobrenadante. Celular Freeze pega a -80 ° C. Purificación de proteínas Buffers: Tampón de Lisis Buffer A (Equilibrio) Tampón B (elución) Acerca de tampón de columna 25 mM de Tris, pH 8,0 200 mM de NaCl 0,5% de glicerol 0,02% de CHAPS 10 mM de imidazol 1 mM TCEP 50 mM de arginina 5 l Benzonase 100 mg lisozima 3 tabletas inhibidor de la proteasa (EDTA libre) 25 mM de Tris, pH 8,0 200 mM de NaCl 10 mM de imidazol 1 mM TCEP 50 mM de arginina 0,25% Glicerol 25 mM de Tris, pH 8,0 200 mM de NaCl 200 mM de imidazol 1 mM TCEP 25 mM de Tris, pH 8,0 200 mM de NaCl 1% Glicerol 1 mM TCEP * Añadir Benzonase, lisozima, y las tabletas de inhibidores de la proteasa a cada muestra de 150 ml inmediatamente antes de la lisis. 8. Lisis celular Hacer 2 L de tampón de lisis; no añadir lisozima, tabletas inhibidores de la proteasa o benzonasa (cada muestra se lisaron por separado en 150 ml de tampón de lisis). Descongelar y volver a suspender pasta de células en tampón de lisis a una masa 1:05: relación de volumen agitando vigorosamente durante 30 min a 4 ° C. Romper trozos sueltos de los lados del vaso de precipitados con una espátula limpia. Durante este período de tiempo preparar Ni y DialyBuffers sis El hielo, la lisis de las células utilizando un aparato de ultrasonidos Misonix (70% de potencia, 2 s encendido / 1 segundo apagado pulsos durante 3 minutos) y con cuidado envase agitar para evitar el sobrecalentamiento. Guardar una pequeña (200 l) alícuota de lisado bruto para el análisis futuro. Aclarar el lisado crudo por centrifugación a 18.000 xg durante 35 min a 4 ° C, recoger el sobrenadante y guardar una pequeña alícuota (200 l) para el análisis futuro. La tienda de pellets a 4 ° C hasta que se confirmó la proteína ha sido lisadas en la fracción soluble. 9. Fabricante de configuración Protein Pre-run Con el fabricante de la proteína activada y el software abierto, inicializar el instrumento. Una vez inicializado, conectar una columna 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF níquel-quelato (Ni columna) en una línea separada del pórtico para cada una de las muestras. Ejecutar 3-4 volúmenes de columna (CV) de tampón de equilibrado a través de cada columna. Cebe el equilibrio y las líneas de tampón de elución. Equilibrcomió las columnas aspirando tampón A través de la columna una vez. 10. Nickel 1 (Ni1) Columna Lave cada columna con 20 ml de agua Milli-Q para eliminar tampón de almacenamiento. Ejecutar 5 ml de tampón B y 25 ml de tampón A para el equilibrado. Cargar el lisado clarificado que contiene proteína solubilizada en las columnas a una velocidad de 2 ml / min, a continuación, siga por un lavado de 15 ml con tampón A. Se eluye la proteína unida en un gradiente por etapas con tampones A y B por las siguientes relaciones respetuosamente: 5 ml de 95:5, 5 ml de 60:40, 10 ml de 0:100. Recoger cada fracción de elución por separado. Analizar: las fracciones eluidas, lisado crudo, lisado aclarado, y el flujo a través de SDS-PAGE. Fracciones piscina que contiene la proteína y el uso de un Nanodrop para medir Un 280 para determinar aproximadamente la cantidad de proteína presente. 11. Ulp1 escisión Mantener una pequeña alícuota (250 l) de la piscina columna Ni1 para posterior análisis en gel. Llevar el restode la piscina Ni1 de 10 ml y añadir ubiquitina proteasa 1 (Ulp1) a 1 l / 5 mg de proteína total para quitar la etiqueta de afinidad Su-SMT. Dializar la piscina Ni1 + Ulp1 frente a 2 l de tampón A durante 4 horas a 4 ° C en unos 10 kDa de corte de peso molecular (MWCO) sobre una placa de agitación a 4 ° C. Después de la diálisis, ejecute SDS-PAGE de Ni1 piscina y Ni1 pool + Ulp1 para determinar si Ulp1 división se ha realizado correctamente. 12. Nickel 2 (Ni2) Columna Carga de proteína escindida sobre la misma columna de Ni y repita el paso 9,3 a un caudal reducido de 1 ml / min. La etiqueta escindido se unirá a la columna y la proteína diana tagless ahora fluirá a través. Recoger el flujo a través en un contenedor fresco. Lavar la columna de Ni con 3 ml de tampón A seguido por 5 ml de tampón B para eluir todas proteína marcada con His y unida no específicamente. Recoger cada fracción por separado. Ejecutar SDS-PAGE de Ni2 flujo a través, lavar y Ni2 fracciones de elución para verificar Ulp1 escote y que prOtein está presente en el flujo a través. Utilice un Nanodrop para medir Un 280 para determinar aproximadamente la presencia de la proteína. 13. Concentrándose Se concentra el flujo a través de Ni2 (y Ni2 elución si la proteína está presente) a 5 ml con un Ultra 10 kDa MWCO tubo de centrífuga Amicon. Haga girar en intervalos de 10 min a 4000 rpm a 4 ° C. Mezclar con una pipeta entre cada giro para evitar que la proteína de un exceso de concentración a lo largo de la membrana. 14. Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) Configurar una S-100 10/30 GL columna de Sephacryl (GE Healthcare) equilibrando con tampón SEC 200 ml a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min en un sistema AKTApurifier (GE Healthcare). Preparar 10 ml superloops para su uso en la columna de la SEC de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Usando una jeringa de 5 ml, cargar muestras en superloops y comience la carrera SEC. Supervisar el seguimiento de absorbancia UV a 280 nm durante la percepción de pequeño volumen fracciones. Ejecutar fracciones SEC a través de SDS-PAGE. Piscina para las fracciones de la SEC que muestran las bandas de mayor intensidad. Concéntrese fracciones SEC agrupados. Consulte el paso 13.1. Proteína alícuotas en 100 muestras l, congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. CRISTALIZACIÓN 15. La cristalización de proteínas Pre-llenar cada depósito de una placa de 96 pocillos compacto cristalización Jr (Emerald Bio) con 80 l de pantalla de cristalización (Esmeralda Bio) de su elección. Diluir proteína con tamaño de búfer de 2-20 mg / ml y almacenar en hielo. Vierta 0,4 l de proteína y 0,4 l de la pantalla de la cristalización en cada uno de los 96 pozos y cubrir con cinta de sellado de cristal claro (Manco). Guarde la placa a 16 ° C, mientras que la comprobación de cristalización de proteínas periódicamente en las próximas semanas bajo un microscopio de disección. 16. Crystal cosecha </ P> Crear un crioprotector a partir del licor madre y el glicol de etileno. Corte la cinta transparente que cubre el pozo con el cristal de proteína diana. Para un pozo vacío, añadir 1,6 l de la condición de cristalización correspondiente y se combinan con 0,4 l de etilenglicol produciendo una concentración final de 20% de glicol de etileno y 80% de cristalización condiciones. Nota: para optimizar difracción de cristal de probar diferentes crioprotectores tales como: glicerol, aceites, polietilenglicoles de bajo PM, y / o en porcentajes variables de la crioprotector. Antes de la cosecha se enfríe un disco de estilo ALS en un Dewar llena con nitrógeno líquido y cubierta con la tapa. Se recoge el cristal mediante la colocación de un CryoLoop con el diámetro interior que corresponde al tamaño del cristal en una varita de cristal magnético (Hampton Research) y recoger directamente de la solución así. Sumergir inmediatamente el CryoLoop con el cristal cosechado en el crioprotector luego sumergirse en el disco de estilo ALS a parpadear congelar la crystal. Repita este procedimiento para un número deseado de cristales. 17. Crystal Screening / Data Collection Una vez que la cosecha se ha completado utilizar una varita puck colocar la tapa magnética crio puck puck en la ALS. Con pinzas dobladas, mueva el disco al revés. Transferir el puck a un Rigaku ACTOR dewar, atornillar un Pusher Puck en el disco, y perforar la tapa dejándola en el dewar con alfileres hacia arriba. El uso de software JDirector, pantalla de cada cristal bajo los siguientes parámetros: hendidura haz ajustado a 0,5 grados, la distancia detector ajustado a 50 mm, paso de la imagen a 70 grados, y la duración de la exposición establece en 30 segundos. Ejecutar MOSFLM en las imágenes de prueba te disparó con JDirector para determinar cuál es el mejor cristal y la estrategia es para la recolección de datos. Recoge un conjunto completo de datos sobre la base de los resultados de MOSFLM. 18. Data Processing / Determinación de la estructura Ejecutar XDS / XSCALE 4 de procesar el conjunto de datos. Abra el paquete de software CCP4. Ejecutar Phaser 5 para calcular una solución de reemplazo molecular utilizando un modelo de búsqueda de alta homología, cuando esté disponible. En este caso se utilizó el 3CW4 PDBID como un modelo de búsqueda 6. Ejecutar Refmac 7 para refinar el modelo molecular en contra de la reflexión que se recogen en el conjunto de datos. Resolución final debe basarse fuera de la más alta shell y determinado por los siguientes parámetros: factor R> 50%, I / sigma> 2, y la exhaustividad> 90%. Construir un modelo de densidad de electrones de 3 dimensiones con el software de gráficos moleculares FOCHA 8. Antes de depositar la estructura en el AP validarlo con el software MolProbity 9 para verificar que la calidad de la estructura es adecuada para la deposición.