Een overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. Moleculaire Biologie 1. Construct Ontwerp Gebruik Gene Composer om eiwit construct codon gemanipuleerde synthetische gensequenties ontwerpen. Het gebruik van Gene Composer software is aangeboden elders uitvoerig 3. Gebruik de Alignment Viewer Module en Construct Ontwerp Module aan eiwit sequentievergelijkingen vergelijken en bepalen eiwit construct. Lijn doelaminozuursequentie aan de primaire en 3D structurele elementen van homologen in de Protein Data Bank (PDB), indien beschikbaar (figuur 2). Gebruik uitlijning informatie aan structuur-begeleide construct ontwerpen te maken door te kiezen voor nieuwe termini gebaseerd op het behoud van de primaire structuur en de 3D-structuren van homologen. Ontwerp insert PCR (iPCR) en vector PCR (vPCR) amplimeren (klem primers). Met behulp van Gene Composer het eiwit naar DNA algoritme back-vertalen construct aminozuursequentie in codon engineered nucleïnezuursequentie. Gebruik de juiste codongebruik tafel (CUT) om de sequentie te optimaliseren voor expressie in E. coli. Vrijwel klonen inzetstuk in pET28 vector gemodificeerd om een N-terminaal 6x histidine-tag en Smt3/SUMO fusie-eiwit dat zorgt voor eenvoudige reiniging nemen. Plaats synthetisch gen om met DNA 2.0 en orde primers van Integrated DNA Technologies. 2. Polymerase Onvolledige Primer Extension (PIPE) Cloning Bereid Primers en Genen Centrifugeer de leverancier verstrekte platen met primers bij 1000 rpm gedurende 1 minuut. Breng primer concentratie 100 pM en voeg 50 ul TE-buffer. Verdun tot 10 uM primers met gedeïoniseerd (DI) water in een 96-well V-bodemplaat. Centrifugeer de leverancier verstrekte gen in een 1,5 ml buis bij 1300 rpm gedurende 1 minuut. <liGebruiken> TE-buffer, breng de DNA concentratie van elke buis 50 ng / ul. In 1,5 ml buizen maken verdunningen van elke primer en 10 ng / ul. WINKEL primers en genen bij -20 ° C indien niet in gebruik. Bereid Insert PCR (iPCR) Ontdooi een flacon van Pfu Master Mix op ijs; houden genen en primers bij kamertemperatuur. Een plaat kaart toewijzen putten een set van primers en construeren. Voeg 13 ul van DI water in elk putje van een 96-well PCR plaat. Voeg 5 ul van voorwaartse en 5 ui reverse primer aan elke reactie in de 96-well plaat volgens de plaat kaart, waardoor tips tussen elk putje veranderen. Voeg 2 pi van elk gen van volledige lengte zijn geschikt voor toepassing volgens de plaat kaart. Voeg 25 ul van Pfu master mix aan elk putje, zorgen om tips tussen elk putje te veranderen. Schakel de reacties met de volgende PCR-omstandigheden: 95 ° C 2 min </li> 95 ° C 30 sec 50 ° C 45 sec 68 ° C 3 min 4 ° C ∞ Herhaal de stappen bd voor 25 cycli. Breng 10 pl van elk iPCR reactie op een nieuwe 96-well PCR plaat. Voeg 3 ul van 6X lading kleurstof aan elk monster. Scheid elk monster op een 1% TAE agarose gel EtBr 110V naast een 100-500 bp DNA fragment amplificatie ladder te bevestigen. WINKEL iPCR product bij -20 ° C indien niet in gebruik (vermijd bevriezen ontdooien zoveel mogelijk). 3. Bereid Vector PCR (vPCR) Begin overnacht cultuur van getransformeerde E. coli met pET28 vector plasmide. Inoculeer twee 5 ml tubes 2 YT-bouillon met 50 ug / ml kanamycine. Groeien kweken overnacht bij 37 ° C schudder bij 220 rpm. Spin down culturen na groei gedurende de nacht door centrifugeren bij 3000 rpm gedurende 15 minuten. Gebruik een Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit voor pET28 vector onttrekken bacteriële pellets volgens de instructies van de fabrikant. Setup restrictie-enzym digesties van gewonnen pET28 plasmide. Voeg 2,2 ui 10X BamHI-buffer en 1 ui BamHI en HindIII 20 ui vector pET28. Incubeer reactiemengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C. Afzonderlijke digestieproduct op een gel. Raadpleeg stap 2.2.10. Gesneden vector band uit gel en zuiveren met behulp van de QIAquick Gel Extraction Kit volgens de instructies van de fabrikant. Met behulp van een NanoDrop, kwantificeren DNA-concentratie. Verdunnen cut vector tot 10 ng / ul. Bewaar bij -20 ° C indien niet in gebruik. Bereid vPCR primers. Centrifugeer IDT geleverd oligonucliotides gedurende 1 min bij 1300 rpm. Breng concentratie tot 100 uM met DI-water. Bereid 10 uM verdunning van zowel voorwaartse en achterwaartse primers in een 1,5 ml buis. WINKEL primers en primer verdunningen bij -20 ° C. Dooi Pfu Master Mix op ijs en dooi template en primers bij kamertemperatuur. Setup vPCR reacties in een 96-wells PCR-plaat: In de eerste rij van een 96-well plaat combineren 60 ui voorwaartse en reverse primers vPCR en 24 gl gedigereerd pET28 matrijs (10 ng / ul). Met behulp van een 12-tip multichannel pipet 12 ul van de primer en een sjabloon master mix aan elk resterende putje van de plaat. Dit moet resulteren in 12 ul van primer en template master mix in elk putje van de plaat. Voeg 13 ul van DI water aan elk putje. Voeg 25 ul van Pfu Master Mix aan elk putje. Cyclus van de reacties via de PCR-condities gebruikt in stap 2.2.7. Pool alle vPCR reacties in een 15 ml Falcon buis. Controleer fragment amplificatie door het scheiden 10 ui gepoolde PCR product op een gel (verwachte lengte van gedigereerde vector pET28ongeveer 6 kb). Raadpleeg stap 2.2.10. Bereid samenvoegen platen. Aliquot 3 pl vPCR product in elk putje van een 96-well V-bodemplaat. WINKEL platen bij -20 ° C tot fusie met iPCR product. 4. Samenvoegen iPCR en vPCR Producten Ontdooien iPCR producten en pre-porties vPCR 96 putjes samengevoegd bij kamertemperatuur. Voeg 3 pi van elke iPCR product aan hun respectieve goed van de merge plaat. Transformeren samenvoegen plaat in Top Tien chemisch competente cellen. Voeg 2 pi van elke merge reactie in een 50 pl buis van vendor-geleverde chemisch competente cellen en ga verder met door de fabrikant geleverde protocol. Bereid overnachtkweken voor elk construct van transformatie plaat. Aliquot 5 ml TB bouillon (met 50 ug / ml kanamycine) uit een 25 ml steriele reservoir in elk putje van een diepe put blok. Met behulp van sterile techniek, kies een geïsoleerde kolonie van elke transformatie bord en enten van de juiste bron van de diepe put blok. Bedek het blok met een Airpore deksel. Schud blok 220 rpm bij 37 ° C geïncubeerd. Pellet cellen door centrifugeren van het blok gedurende 30 min bij 4000 rpm. Giet het supernatant en dep de bovenkant van het blok droog met een papieren handdoek. Mini-prep met een Qiagen 96 putjes vacuuminrichting volgens de instructies van de fabrikant. 5. Bereiden glycerol voorraden van succesvol Gekloonde Constructs Transformatie met succes gekloneerde sequentie gevalideerd DNA in BL21 (DE3) chemisch competente cellen volgens de instructies van de fabrikant. Voor elk construct, kies een afgelegen kolonie van de BL21 (DE3) transformatie en enten in 1 ml 2-YT bouillon (met 50 ug / ml kanamycine). Schud kweken bij 220 rpm gedurende 3-4 uur bij 37 ° C. Label een 1,5 mlschroefdop buis met de unieke constructie identificatienummer, celstam, en datum. Voeg 500 ul van 50% glycerol en 500 ul celkweek en zwenken meerdere malen. Onmiddellijk slaan glycerol voorraad op droog ijs of in een -80 ° C vriezer. 6. Expression Testen Lysis Buffe r Wash Buffer Elution Buffer 50 mM NaH 2PO 4, pH 8,0 300 mM NaCl 10 mM imidazool 1% Tween 20 2 mM MgCl2 0,1 ul / ml Benzonase 1 mg / ml lysozym 50 mM NaH 2PO 4, pH 8,0 300 mM NaCl 20 mM imidazool 0,05% Tween 20 25 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazool 0,05% Tween 20 * Benzonase toevoegen, lysozym,en protease inhibitor onmiddellijk vóór lyse. Streak een monster uit glycerol voorraad op kanamycine selectieve agar en incubeer overnacht bij 37 ° C. Start een niet-inducerende pre-culture in een 96-putjes met ronde bodem blok, ent 1,2 ml TB medium (met 50 mg / ml kanamycine) aangevuld met 0,5% glucose met vers gekweekte E. coli isoleren. Grow 's nachts schudden bij 220 tpm bij 37 ° C. Na een nacht kweken, start inductie kweken door het enten van 1,2 ml TB medium (met 50 mg / ml kanamycine) gesupplementeerd met Novagen Overnight Express Systeem 1 (volgens het protocol van de fabrikant) met 40 ul van de pre-cultuur. Grow de kleinschalige inductie kweken bij 20 ° C gedurende 48 uur, schudden bij 220 rpm. Oogst cellen door centrifugeren bij 4000 rpm gedurende 15 min, giet supernatant en bewaar bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur vóór de verwerking. In het 96-well blok, resuspendeer de celpellets in 300 pi lysisbuffer. </li> Incubeer cellen in lysis buffer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten gevolgd door een mechanische lysis door schudden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verduidelijken het ruwe lysaat door centrifugatie gedurende 30 minuten bij 4000 rpm bij 4 ° C. Gebruik van een multi-channel pipet 200 ul van de geklaarde lysaat (oplosbare fractie) over aan een 96 putjes vlakke bodemplaat (Qiagen). Voor elk putje een monster, voeg 40 pl Ni-NTA magnetische korrels (Qiagen). Schud voorzichtig de plaat op een rocker gedurende 1 uur bij 16 ° C. Plaats de plaat op een magnetische paal plaat (Qiagen) en verwijder de ongebonden oplosbare fractie. Zorg om geen pipet uit een van de Ni-NTA beads. Verwijder de plaat uit de post plaat en voorzichtig geresuspendeerd de kralen in 200 ul wasbuffer. Pipet op en neer gedurende 30 seconden en plaats de plaat terug op de post plaat. Verwijder de wasbuffer en herhaal stap 6.12. Verwijder de plaat uit post plaat en elueren de Ni-NTA gebonden target eiwit door wassen met 50 ul elutiebuffer gedurende 5 minuten. Terug vlakke bodemplaat aan magnetische bericht plaat en breng de elutie om een frisse 96-v-bodemplaat. Breng 20 pl van de elutie om een nieuwe 96-well V-bodemplaat en 1 pi ULP1 protease reageren. Volgens protocol van de fabrikant, het analyseren van de geëlueerde en geëlueerd + Ulp1 fractie door capillaire elektroforese met een LabChip 90. Alternatief kunnen alle fracties uit de expressie tests geanalyseerd via SDS-PAGE. 7. Fermentatie op grote schaal Gebruik een steriele pipet tip om een schrapen verkrijgen uit een glycerol voorraad, enten 100 ml TB bouillon (met 50 mg / ml kanamycine) en groeien 's nachts. Schudden bij 220 rpm en 37 ° C. Na een nacht groei, uitbreiding van pre-cultuur door het enten 1 L van TB bouillon met EMD autoinductie oplossingen (zie protocol van de fabrikant) (met 50 mg / ml kanamycine) in een 2 L chicanekolven met 10 ml van depre-cultuur (1:100 verdunning). Schud de geëxpandeerde 1 L kweken bij 37 ° C, verandert de temperatuur van de incubator schudden tot 20 ° C bij een optische dichtheid van 0,6 (OD 600) wordt bereikt. Na een nacht groei, een representatief 10 ml aliquot van elk construct voor expressie testen. Celpasta oogst door centrifugatie bij 5000 rpm gedurende 15 min en gooi supernatant. Freeze cel plakken bij -80 ° C. Eiwitzuivering Buffers: Lysis Buffer Buffer A (Equilibration) Buffer B (elutie) Sizing Column Buffer 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 0,5% glycerol 0,02% CHAPS 10 mM imidazool 1 mM TCEP 50 mM Arginine 5 pl Benzonase 100 mg lysozym 3 Proteaseremmer Tabletten (EDTA-free) 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 10 mM imidazool 1 mM TCEP 50 mM Arginine 0.25% glycerol 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 200 mM imidazool 1 mM TCEP 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 1% glycerol 1 mM TCEP * Voeg Benzonase, lysozym, en proteaseremmer tabletten u elke 150 ml monster onmiddellijk voor lysis. 8. Cell Lysis Voeg 2 L lysis buffer, niet lysozym, protease inhibitor tabletten of benzonase (elk monster afzonderlijk gelyseerd in 150 ml lysis buffer) toegevoegd. Ontdooien en resuspendeer celpasta in lysis buffer op 01:05 gewicht: volume verhouding door krachtig roeren gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Breken brokken los van zijkanten van de beker met een schone spatel. Gedurende deze periode bereiden Ni en Dialysis Buffers Op ijs, lyseren van de cellen met een Misonix sonicator (70% vermogen, 2 sec aan / 1 sec uit pulsen gedurende 3 min) en container voorzichtig zwenken om oververhitting te voorkomen. Sla een klein (200 pl) hoeveelheid van ruw lysaat voor toekomstige analyse. Verduidelijken het ruwe lysaat door centrifugatie bij 18.000 xg gedurende 35 min bij 4 ° C, verzamel de supernatant en slaan een kleine (200 ul) aliquot voor toekomstige analyse. WINKEL pellet bij 4 ° C totdat het wordt bevestigd eiwit gelyseerd in de oplosbare fractie. 9. Pre-run Protein Maker Setup Met het eiwit maker aangezet en de software te openen, initialiseren van het instrument. Eenmaal geïnitialiseerd, plak een 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nikkel-chelaatkolom (Ni column) op een aparte lijn van het portaal voor elk van de monsters. Run 3-4 kolomvolumes (CV) van equilibreerbuffer door elke kolom. Primen het evenwicht en elutiebuffer lijnen. Equilibrat de kolommen opzuigen buffer A door de kolom eenmaal. 10. Nikkel 1 (Ni1) Column Wassen elke kolom met 20 ml Milli-Q water tot opslag buffer te verwijderen. Run 5 ml buffer B en 25 ml buffer A voor evenwicht. Laad de geklaarde lysaat bevattende oplosbaar eiwit in de kolommen met een snelheid van 2 ml / min daarna volgen door een 15 ml wassing met buffer A. Elueren van het gebonden eiwit in een stap verloop met buffers A en B door de volgende verhoudingen respectvol: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Verzamel elk elutiefractie afzonderlijk. Analyseren: geëlueerde fracties, ruw lysaat, verduidelijkt lysaat en doorstroming door SDS-PAGE. Pool fracties die het eiwit en gebruikt een Nanodrop meten A 280 tot ongeveer het bedrag aanwezig eiwit. 11. ULP1 Splitsing Houd een kleine hoeveelheid (250 pl) van de Ni1 kolom zwembad voor latere gelanalyse. Breng de restvan de Ni1 zwembad tot 10 ml en voeg ubiquitine-achtige protease 1 (ULP1) op 1 pl / 5 mg totaal eiwit aan het His-Smt affiniteitslabel verwijderen. Dialyseer de Ni1 pool + ULP1 tegen 2 L buffer A gedurende 4 uur bij 4 ° C in een 10 kDa moleculair gewicht cutoff (MWCO) op een roerplaat bij 4 ° C. Na de dialyse uitvoeren SDS-PAGE van Ni1 zwembad en Ni1 zwembad + ULP1 om te bepalen of ULP1 decollete succesvol was. 12. Nikkel 2 (Ni2) Column Laad gekloofd eiwit over dezelfde kolom Ni en herhaal stap 9.3 tegen een gereduceerd debiet van 1 ml / min. Het gesplitste off tag zal binden aan de kolom en de tagless doelproteïne stroomt nu-door. Verzamel de doorstroming in een nieuwe container. Was Ni kolom met 3 ml buffer A, gevolgd door 5 ml buffer B tot alle His-tag en specifiek gebonden eiwit elueert. Verzamel elke fractie afzonderlijk. Run SDS-PAGE van Ni2 doorstroom, wassen en Ni2 elutiefracties om ULP1 decollete controleren en dat protein aanwezig in de doorstroom. Gebruik Nanodrop meten A 280 om de aanwezigheid van eiwit ruwweg bepalen. 13. Concentreren Concentreer de Ni2 doorstroom (en Ni2 elutie of eiwit aanwezig is) om een Amicon Ultra 10 kDa MWCO centrifugebuis 5 ml. Spin in 10 min intervallen bij 4.000 tpm bij 4 ° C. Meng met een pipet tussen elke draai om eiwitten te voorkomen over-concentratie langs membraan. 14. Maat-uitsluiting chromatografie (SEC) Stel een Sephacryl S-100 10/30 GL kolom (GE gezondheidszorg) door equilibreren met 200 ml SEC buffer met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min op AKTApurifier systeem (GE Healthcare). Bereid 10 ml superloops voor gebruik op de kolom SEC volgens de instructies van de fabrikant. Met behulp van een 5 ml spuit, laden monsters op superloops en beginnen de SEC run. Toezien op de UV-absorptie trace bij 280 nm, terwijl het verzamelen klein volume fracties. Voer SEC fracties via SDS-PAGE. Zwembad de SEC fracties met de hoogste intensiteit bands. Concentreer gepoolde SEC fracties. Zie stap 13.1. Aliquot eiwit in 100 ul monsters, flash bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. KRISTALLISATIE 15. Eiwit Kristallisatie Pre-fill elk reservoir van een 96-well Compact Jr kristallisatie (Emerald Bio) met 80 ul van kristallisatie scherm (Emerald Bio) naar keuze. Verdunnen eiwit met dimensionering buffer tot 2-20 mg / ml en op te slaan op ijs. Doseer 0,4 ul van eiwitten en 0,4 ul van de kristallisatie scherm in elk van de 96-wells en bedek met kristalhelder afdichtingsband (Manco). Bewaar de plaat bij 16 ° C, terwijl het controleren op eiwitkristallisatie periodiek de komende weken onder een dissectie microscoop. 16. Crystal Oogsten </ P> Maak een cryoprotectant van de moederloog en ethyleenglycol. Snijd de duidelijke tape op de goed bij de doelgroep eiwit kristal. Een lege well 1.6 ul van de desbetreffende aandoening en kristalliserende combineren met 0,4 gl ethyleenglycol waardoor een eindconcentratie van 20% ethyleenglycol en 80% kristalliseren conditie. Opmerking: voor kristaldiffractie optimaliseren proberen verschillende cryobeschermingsmiddelen zoals glycerol, oliën, lage MW polyethyleenglycolen en / of variërende percentages van het koude beschermend middel. Voor de oogst afkoelen een ALS-stijl puck in een Dewar gevuld met vloeibare stikstof en dek af met deksel. Oogst de kristallen door een CryoLoop de binnendiameter overeenkomt met de grootte van het kristal op een magnetische Crystal Wand (Hampton Research) en schep het rechtstreeks uit de bron oplossing. Onmiddellijk dip de CryoLoop met de geoogste kristal in de cryoprotectant vervolgens onderdompelen in de ALS-stijl puck te knipperen bevriezen de crystal. Herhalen voor een gewenst aantal kristallen. 17. Crystal Screening / Data Collection Zodra oogsten is voltooid gebruik een puck toverstok om de magnetische cryo puck deksel leggen op de ALS puck. Met gebogen tang, flip de puck op zijn kop. Breng de puck naar een Rigaku ACTEUR Dewar, schroef een Puck Pusher op de puck, en pons het deksel eraf verlaten van het in de Dewar met pennen naar boven. Met behulp JDirector software, scherm elk kristal onder de volgende parameters: beam spleet ingesteld op 0,5 graden, detector afstand ingesteld op 50 mm, image stap naar 70 graden, en de lengte belichting ingesteld op 30 sec. Draaien Mosflm op de test beelden die u opnam met JDirector te bepalen wat de beste kristal en strategie is voor het verzamelen van gegevens. Verzamel een volledige dataset op basis van uw resultaten uit Mosflm. 18. Data Processing / structuurbepaling Run XDS / XSCALE 4 op de dataset te verwerken. Open de CCP4 suite software. Run Phaser 5 een moleculaire vervangende oplossing om met een hoge homologie zoeken model, indien beschikbaar berekenen. In dit geval hebben we de PDBID 3CW4 als een zoektocht model 6. Run Refmac 7 om uw moleculair model te verfijnen tegen de waargenomen reflectie in de dataset verzameld. Definitieve oplossing moet worden gebaseerd off van de hoogste schaal en wordt bepaald door de volgende parameters: R-factor> 50%, I / sigma> 2 en volledigheid> 90%. Bouw een 3-dimensionale elektronendichtheid model met de moleculaire grafische software COOT 8. Vóór de neerlegging van de structuur van het VOB valideren met MolProbity 9 software om die kwaliteit van de structuur controleren is geschikt voor depositie.