基于结构的药物设计在药物发展中起着重要的作用。并行追求多个目标,率先发现的成功的机会大大增加。下面的文章强调了西雅图结构基因组学中心传染病流感A亚基PB2基因到结构的确定采用了多目标的方法。
大流行暴发的高致病性流感病毒株能引起广泛的发病率和死亡率在全球人群。仅在美国,平均41,400人死亡,186万人住院,是由流感病毒感染引起的,每年1。点突变在聚合酶碱性蛋白亚基(PB2)已与适应的病毒感染在人类2。从这些研究结果揭示的生物学意义PB2作为一个致病因素,从而突出它的潜力作为一种抗病毒药物的目标。
提出由美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)的结构基因组学计划提供资金绿宝生物和其他三个西北太平洋机构一起组成了西雅图的结构基因组学中心传染病(SSGCID)。致力于提供科学界三个SSGCID维E蛋白结构NIAID类别AC病原体的。这样的结构信息提供给科学界提供加速基于结构的药物设计。
基于结构的药物设计在药物发展中起着重要的作用。并行追求多个目标,目标的途径或整个蛋白家族的新先导化合物的发现成功的机会大大增加。翡翠生物已开发出一种高通量,多目标并行处理流水线(MTPP)基因到结构的决心,以支持该财团。在这里,我们描述了协议,用于确定从四个不同的A型流感毒株PB2亚基的结构。
多目标并行处理的
基于结构的药物设计在药物发现中起着重要的作用。 SSGCID致力于提供科学界与蛋白质三维结构从NIAID的类别为AC病原体。制作这种结构广泛地提供信息,最终将有助于加快基于结构的药物设计。
MTPP方法的第一个关键步骤是结构设计。每一个目标蛋白质的多重结构,增加成功的结构测定和增加周转的概率。这是不可避免的,一些蛋白质结构的管道阶段将失败。实施管道克隆方法支持MTPP方法允许在96孔板中没有劳动密集型的纯化步骤一代的许多构造。配对管克隆与蛋白表达的分析能力,在同一96孔板(卡尺实验室芯片90)进一步加快的总体流程。这些方法允许配对的结构,产生可溶性蛋白,确保大规模蛋白质生产和纯化的成功,可快速识别。
MTPP高通量的成功的一个重要方面是蛋白质制造商(美国专利第6818060号,翡翠生物)仪表。蛋白质的制造商是一个24通道平行液相色谱系统专门开发的高通量蛋白的生产和相关的结构基因组管道研究中的应用,以提高效率。使用先前描述的协议,用于蛋白设备单行FPLC系统相比,其优点是明显的。一个单个的人能净化并联多达48个目标,在8小时内。与此相反,一个人使用一个单一的线FPLC系统只能净化的和最多4个目标,在相同的时间内。高含量的纯度为每个目标实现与蛋白质制造商日益增长的蛋白质晶体结构分析在后来的成功是一个关键因素。
限制和故障排除
求解三维结构,可通过X-射线晶体是一个多级着许多挑战,其中之一是不能获得大量的可溶性靶蛋白的努力。克服的溶解度问题,可以实现的一种策略是使用的另一种表达宿主为E。大肠杆菌细胞无法执行几个重要的真核翻译后修饰。在各酵母中的表达,昆虫和哺乳动物细胞系的能够执行这些翻译后修饰的往往是一个合适的替代品。有时靶蛋白表达,但完全不溶于标准的裂解条件下。蛋白质Maker可以替代细胞裂解条件下的快速检测是一种宝贵的资源Smith 等人所描述的。 2011 13。这一战略往往是必要的,以保持通过管道移动的目标。在任何结构基因组学研究的管道,标准化的协议可能不适合每一个目标,通过管道和目标,可能需要单独的优化。例如,我们选择使用20%的乙二醇为每个冷冻保护剂。替代冷冻保护剂或浓度的情况下,这种情况是不适合的,可能需要进行测试。
由于每个单独的靶蛋白的独特性质,速率限制和不可预知的步骤中确定的结构是结晶。 MTPP管道偏移通常成功率很低的蛋白质结晶优化从最初的稀疏矩阵屏幕。每个初始晶体市售稀疏矩阵屏幕击中进一步优化电子屏幕生成器(翡翠生物)。优化屏幕设计的ARound的条件的初始晶体命中的,改变浓度的缓冲液,盐,和添加剂。成功的优化屏幕产生适合衍射研究和结构测定的晶体。
提出由美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)的结构基因组学计划提供资金绿宝生物和其他三个谁一起是SSGCID的(绿宝生物SeattleBiomed,华盛顿大学和西北太平洋国家实验室的西北太平洋机构) 。 NIAID的结构基因组计划的完成目标所需的国家的最先进的应用技术,每个成员的财团被选定为他们的专业知识。日期,SSGCID已交存461结构到PDB排名为世界第七大贡献者,并在2011年,最有生产力的。提供的协议和方法SSGCID的意图受益科学界和延续传染病的研究。
The authors have nothing to disclose.
笔者想感谢所有成员的SSGCID财团。所有团队成员的努力,在翡翠生物的巨大成就SSGCID的目标成为可能。资助这项研究是根据联邦的合同号HHSN272200700057C从国立过敏和传染病研究所,国立健康和卫生与人类服务部。
Item | Vendor | Catalog number |
Primers | IDT | |
Genes | DNA 2.0 | |
TE buffer | Qiagen | provided in kit |
96-well half skirt PCR plates | VWR | 10011-248 |
PFU Master Mix | ||
6X Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 |
10X TAE | Teknova | T0280 |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G |
pET28 vector | ||
2-YT Broth | VWR | 101446-848 |
Kanamycin | Teknova | K2151 |
Restriction Enzymes | Fermentas | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
Top 10 chemically comp cells | Invitrogen | C4040-06 |
Disposable Troughs (Sterile, 25 ml) | VWR | 89094-662 |
Airpore covers (Rayon films for bio cultures) | VWR | 60941-086 |
24-well blocks | VWR | 13503-188 |
QIAvac 96 | Qiagen | 19504 |
BL21(DE3) cells chemcomp (phageR) | NEB | C2527H |
50% Glycerol | VWR | 100217-622 |
TB Media | Teknova | T7060 |
IPTG | Sigma-Aldrich | |
1 M Tris pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM |
5 M NaCl | Teknova | S0251 |
Glycerol | Aldrich | G7893-4L |
CHAPS | JT Baker | 4145-01 |
Imidazole | Sigma | 56749-1KG |
TCEP | Amresco | K831-10G |
L-arginine | Amresco | 0877-500G |
Benzonase | EMD | 70746-3 |
Lysozyme | USB | 1864525GM |
10 kDa MWCO dialysis tubing | Thermo | 68100 |
Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators | Millipore | UFC901024 |
HisTrap FF columns | GE | 17-5255-01 |
HiTrap Chelating columns | GE | 17/0408-01 |
Compact Jr crystallization plates | Emerald Bio | EBS-XJR |
Crystalization screens | Emerald Bio | |
Ethylene Glycol 100% | Emerald Bio | EBS-250-EGLY |
Crystal Wand Magnetic Straight | Hampton Research | HR4-729 |
Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm | Hampton Research | HR4-955 |
ALS style puck | ||
Puck Wand | ||
Bent Tongs | ||
Puck Pusher |