Summary

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

Published: October 01, 2012
doi:

Summary

השתלת מח עצם מספקת דרך לשנות את הגנוטיפ של תאים שמקורם במח עצם. אם הגן של העניין בא לידי ביטוי בשני תאי מח עצם ותאים שמקורם במח שאינם נגזרים עצם, השתלת מח עצם יכולה לשנות את התאים שמקורם במח עצם לגנוטיפ שונה מבלי לשנות את גנוטיפ התאים לא נובע מח העצם.

Abstract

כדי להבין את תפקידו של גן בהתפתחות הדלקת במעי גס, השווה את התגובות של עכברי סוג פראי ועכברי נוקאאוט החסרים הגנטית של ריבית לקוליטיס. אם הגנים של האינטרס מתבטא בשני תאי מח עצם ותאי שמקורם נובעים מח עצם שאינם של המארח, עם זאת, ניתן להבחין את התפקיד של גן של עניין בתאי מח עצם ומקורם במח עצם שאינו תאים שהופקו על ידי טכניקת השתלת מח עצם. כדי לשנות את הגנוטיפ מח העצם נגזר תאים של עכברים, מח העצם המקורי של עכברי נמען נהרסו על ידי הקרנה ולאחר מכן הוחלף על ידי מח עצם מתורם החדש של גנוטיפ השונה. כאשר מח עצם פראי מסוג עכברי תורם הושתל בעכברי נוקאאוט, אנו יכולים לייצר עכברי נוקאאוט עם ביטוי גנים פראי מסוג תאים שמקורם במח עצם. לחלופין, כאשר מח עצם מתורם עכברי נוקאאוט הושתל בעכברי נמען סוג פראי, עכברי סוג פראי ללא גנים של האינטרס להביעממח עצם תאים שמקורם יוצרו. עם זאת, השתלת מח עצם לא יכולה להיות 100%. לכן, אנו מנוצלים מקבץ של בידול מולקולות (CD) (CD45.1 וCD45.2) כסמנים של תאי תורם ומקבל כדי לעקוב אחר שיעור תאי מח עצם מתורם נגזרים בעכברי נמען והצלחה של השתלת מח עצם. עכברי סוג פראי עם CD45.1 עכברי גנוטיפ ונוקאאוט עם גנוטיפ CD45.2 היו בשימוש. לאחר ההקרנה של עכברי נמען, את תאי מח העצם של תורם גנוטיפים שונים שהחדירו לתוך עכברי הנמען. כאשר מח העצם החדש מחדש להשתלט על חסינותה, העכברים היו לערער על ידי סוכן כימי (נתרן גופרתי dextran, DSS 5%) כדי לגרום לדלקת מעי גס. הנה גם אנחנו הראינו את השיטה כדי לגרום לדלקת המעי גס בעכברים ולהעריך את תפקידו של הגן של עניין הביע מתאי שמקורם של מח עצם. אם הגנים של האינטרס מהתאים שמקורם העצם ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות המחלה (כגון coliTIS), הפנוטיפ של עכברי נמען עם השתלת מח עצם ניתן לשנות באופן משמעותי. בתום ניסויי קוליטיס, מח העצם נגזר תאי דם ובמח עצם תויגו עם נוגדנים נגד CD45.1 וCD45.2 והיחס הכמותי שלהם לקיום יכול לשמש כדי להעריך את ההצלחה של השתלת מח עצם על ידי cytometry זרימה. השתלת מח עצם מוצלחת צריכה להראות רוב מכריע של גנוטיפ תורם (בטווח של מולקולת סמן תקליטור) על הגנוטיפ נמען הוא במח העצם והדם של עכברי נמען.

Protocol

1. לפני שאתה מתחיל, שיקולים טכניים אנו ממליצים להשתמש בשני עכברי C57/BL6 סוג פראי ועכברי נוקאאוט לניסוי כי עכברים עם מולקולות CD מתאימות ניתן לרכוש מיצרני העכברים גדולים. מכיוון שקשה לעקוב אחר ע?…

Representative Results

אם הגנים של האינטרס ממלא תפקיד משמעותי בתאי מערכת חיסוניים במהלך פיתוח של קוליטיס, העכברים שקבלו מח עצם של גנוטיפ השונה באמצעות השתלת מח עצם (WT לKO KO או לWT) צריך להיות תגובה שינתה לקוליטיס DSS. אחד הפרמטרים החשובים ביותר לקביעת החומרה של קוליטיס היא צביעת H & E של רקמות ה…

Discussion

גישת השתלת מח עצם זה מתאים למחקר אימונולוגיה של דלקת מעי גס, זיהום, סרטן, השמנת יתר ומחלות אחרות. ניסוי השתלת מח עצם זה נחוץ כאשר הגנים של האינטרס מתבטא הוא במח העצם נגזר ותאים שאינם מח עצם נגזרות וגנים של האינטרס הוא חשוד לתווך מחלה על ידי תאים מאו אוכלוסייה. לדוגמה, מי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מענק פיילוט ובדיקת היתכנות מאוניברסיטת UCLA-CURE מרכז, קרוהן וקוליטיס קרן פרס אמריקה פיתוח קריירה (# 2691) והמכון הלאומי לבריאות NIDDK K01 (DK084256) מימון לכב וואי Koon של.

פעולת הקרנת מח העצם נעזרה בברנרד לוין ומטבח סקוט של UCLA מרכז לחקר איידס עכבר / מתקן Core כימרה אנושי. פעולת זרימת cytometry נעזרה במתקן Core וקטור-UCLA.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Cell staining buffer Biolegend #420201
10X RBC lysis buffer Biolegend #420301
FITC mouse isotype control Biolegend #400207
PE mouse isotype control Biolegend #400211
PE anti-mouse CD45.2 Biolegend #109807
FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend #110705
Anti-mouse CD16/32 blocking Biolegend #101301
40 μm cell strainer Fisherbrand #22363547
PBS 1X MP biomedicals #1860454
Heparin Fisherbrand #BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (fisher)
Lysol IC Andwin Scientific NC9745686 (fisher)
Vaccutainer BD #8000813
Mouse restrainer Braintree Scientific #TV-150
Irradiator J.L. Shepherd and Associates Mark I 68A
Flow cytometer BD BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube Falcon #352052
Digital caliper Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult ICT Beckman Coulter G0328QW

References

  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
  3. Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
  4. Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
  5. Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
  6. Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
  7. Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
  8. Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
  9. Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
  10. Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
  11. Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
  12. Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
  13. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
  14. Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).

Play Video

Cite This Article
Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation. J. Vis. Exp. (68), e4208, doi:10.3791/4208 (2012).

View Video