Summary

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

Published: October 01, 2012
doi:

Summary

Knochenmarktransplantation bietet eine Möglichkeit, um den Genotyp der Knochenmark stammende Zellen zu ändern. Wenn das Gen von Interesse an beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen exprimiert wird, kann die Knochenmarktransplantation Knochenmark stammende Zellen zu einem anderen Genotyp ändern, ohne die nicht-Knochenmark stammende Zellen Genotyp.

Abstract

Um die Rolle von einem Gen in der Entwicklung einer Kolitis verstehen, verglichen wir die Antworten von Wildtyp-Mäusen und Gen-von-Interesse-defizienten Knockout-Mäuse zu ulcerosa. Wenn die Gen-von-Interesse in beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen des Wirts exprimiert wird, jedoch ist es möglich, die Rolle eines Gens von Interesse in Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark differenzieren abgeleiteten Zellen durch Knochenmarktransplantation Technik. Um das Knochenmark stammende Zellen Genotyps von Mäusen zu verändern, wurden die ursprünglichen Knochenmark des Empfängers Mäusen durch Bestrahlung zerstört und dann durch neue Spender-Knochenmark verschiedener Genotypen ersetzt. Wenn Wildtyp-Mäusen Spender-Knochenmark, um Knockout-Mäuse transplantiert wurde, konnten wir erzeugen knockout Mäuse mit Wildtyp-Gen-Expression in Knochenmark stammende Zellen. Alternativ wurde bei Knockout-Mäusen Spender-Knochenmark zu Wildtyp-Empfängermäuse, Wildtyp-Mäusen ohne Gen-of-interest Ausdruck transplantiertaus Knochenmark stammenden Zellen produziert wurden. Allerdings kann eine Knochenmarktransplantation nicht 100% abgeschlossen. Daher verwendeten wir cluster of differentiation (CD) Moleküle (CD45.1 und CD45.2) als Marker von Spender und Empfänger-Zellen, den Anteil der Spender-Knochenmark-abgeleiteten Zellen in Empfängermäuse und der Erfolg der Knochenmarktransplantation verfolgen. Wildtyp-Mäuse mit CD45.1 Genotyp und Knockout-Mäusen mit CD45.2 Genotyps verwendet wurden. Nach der Bestrahlung des Empfängers Mäusen wurden die Donor Knochenmarkzellen von unterschiedlichen Genotypen in die Empfänger-Mäuse infundiert. Wenn der neue Knochenmark zu übernehmen ihre Immunität regeneriert wurden die Mäuse durch chemische Mittel (Dextran Natriumsulfat, 5% DSS) herausgefordert, Kolitis zu induzieren. Hier zeigten auch die Methode ulcerosa in Mäusen zu induzieren und zu bewerten, die Rolle des Gens von Interesse aus dem Knochenmark stammenden Zellen exprimiert. Wenn die Gen-von-Interesse aus den Knochen abgeleiteten Zellen spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Erkrankung (z. B. colitis) kann der Phänotyp der Empfängermäuse mit Knochenmarktransplantation signifikant verändert werden. Am Ende der Colitis Experimenten abgeleitete das Knochenmark Zellen in Blut und Knochenmark mit Antikörper wurden gegen CD45.1 und CD45.2 bezeichnet und deren Mengenverhältnis der Existenz könnte verwendet werden, um den Erfolg der Knochenmarktransplantation mittels Durchflusszytometrie ausgewertet werden. Erfolgreiche Knochenmarktransplantation sollte eine überwiegende Mehrheit der Donorgenotyp (in der Bezeichnung des CD-Molekül Marker) über Empfänger Genotyp sowohl im Knochenmark und Blut des Empfängers Mäusen.

Protocol

Ein. Before-you-Start Technische Überlegungen Wir empfehlen die Verwendung sowohl C57/BL6 Wildtyp-Mäusen und-Knockout-Mäusen für das Experiment, weil Mäuse mit entsprechenden CD-Moleküle von den großen Maus-Anbieter erworben werden kann. Da es schwierig ist, die Wildtyp-Mäusen und Knockout-Mäusen gewonnen Spenderzellen nach Knochenmarktransplantation zu verfolgen, ist es notwendig, CD45.1 Mäuse verwenden, um Wildtyp-Mäusen darstellen. (CD45.1 C57/SJL WT Mäusen Jackson Laboratories stock …

Representative Results

Wenn das Gen-of-Interest spielt eine bedeutende Rolle in Immunzellen bei der Entwicklung ulcerosa, Empfangen die Mäuse Knochenmark von unterschiedlichen Genotyp durch Knochenmarktransplantation (WT KO oder KO zu WT) sollte eine veränderte Reaktion auf DSS Kolitis. Einer der wichtigsten Parameter zur Bestimmung der Schwere von ulcerosa ist die H & E-Färbung der Colon-Geweben. Colongewebe Struktur ändert und Entzündungszeichen kann quantitativ durch H & E Histologie Scoring-System ausgewertet werden. Kriterie…

Discussion

Diese Knochenmarktransplantation Ansatz ist geeignet für immunologische Forschung von Colitis, Infektionen, Krebs, Fettleibigkeit und andere Krankheiten. Dieses Experiment Knochenmarktransplantation ist erforderlich, wenn das Gen-von-Interesse in beiden Knochenmark stammen und nicht-Knochenmark stammende Zellen und das Gen-von-Interesse vermutet wird, um Krankheiten durch Zellen aus entweder Population vermitteln exprimiert wird. Zum Beispiel wird gezeigt, antimikrobiellen Peptids Cathelizidin zu modulieren akute Kolit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Pilot-und Machbarkeitsstudie Zuschuss von UCLA-CURE Center, der Morbus Crohn und Colitis Foundation of America Career Development Award (# 2691) und National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) Mittel zur Hon Wai Koon finanziert.

Knochenmark Bestrahlung Operation wurde von Bernard Levin und Scott Kitchen of UCLA Center for AIDS Research Maus / Human Chimera Core-Anlage unterstützt. Durchflusszytometrie Operation wurde von UCLA Vector Core-Anlage unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Cell staining buffer Biolegend #420201
10X RBC lysis buffer Biolegend #420301
FITC mouse isotype control Biolegend #400207
PE mouse isotype control Biolegend #400211
PE anti-mouse CD45.2 Biolegend #109807
FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend #110705
Anti-mouse CD16/32 blocking Biolegend #101301
40 μm cell strainer Fisherbrand #22363547
PBS 1X MP biomedicals #1860454
Heparin Fisherbrand #BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (fisher)
Lysol IC Andwin Scientific NC9745686 (fisher)
Vaccutainer BD #8000813
Mouse restrainer Braintree Scientific #TV-150
Irradiator J.L. Shepherd and Associates Mark I 68A
Flow cytometer BD BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube Falcon #352052
Digital caliper Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult ICT Beckman Coulter G0328QW

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Cite This Article
Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation. J. Vis. Exp. (68), e4208, doi:10.3791/4208 (2012).

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