Summary

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

Published: October 01, 2012
doi:

Summary

Beenmergtransplantatie geeft een manier om het genotype van het beenmerg afgeleide cellen. Als het gen van interesse tot expressie wordt gebracht in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen kan beenmergtransplantatie wijzigen beenmerg afgeleide cellen een ander genotype zonder de niet-beenmerg cellen genotype.

Abstract

Om de rol van een gen in de ontwikkeling van colitis begrijpen, vergeleken we de reactie van wild-type muizen en gen-van-belang deficiënte knockout muizen colitis. Als het gen-van-belang wordt uitgedrukt in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen van de gastheer, maar is het mogelijk om de rol van een gen van belang onderscheid in van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen door beenmergtransplantatie techniek. Het beenmerg afgeleide cellen genotype muizen veranderen, werden de oorspronkelijke beenmerg van ontvangende muizen vernietigd door bestraling en vervangen door nieuwe donor beenmerg van verschillende genotype. Wanneer wild-type muizen donor beenmerg getransplanteerd knockout muizen, kunnen we genereren knockout muizen met wild-type genexpressie in van beenmerg afgeleide cellen. Als alternatief werd toen knockout muizen donor beenmerg getransplanteerd naar wild-type ontvangende muizen, wild-type muizen zonder gen-van-een blijk van belangstellingvan beenmerg afgeleide cellen geproduceerd. Kan echter beenmergtransplantatie niet 100% volledig zijn. Daarom gebruikten we cluster van differentiatie (CD) moleculen (CD45.1 en CD45.2) als markers van donor en ontvangende cellen het percentage van donor beenmerg afgeleide cellen in de ontvangende muizen en succesvolle beenmergtransplantatie volgen. Wild-type muizen met CD45.1 genotype en knockout muizen met CD45.2 genotype werden gebruikt. Na bestraling van ontvangende muizen werden de donor beenmergcellen van verschillende genotypen ingebracht in de ontvangende muizen. Wanneer de nieuwe beenmerg geregenereerde over te nemen immuniteit, werden de muizen uitgedaagd door chemisch middel (dextran natriumsulfaat, DSS 5%) colitis te induceren. Hier bleek ook de methode colitis te induceren in muizen en evalueren van de rol van het gen van interesse tot expressie gebracht uit beenmerg afgeleide cellen. Als het gen-van-belang van het bot afgeleide cellen speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van de ziekte (zoals colitis), kan het fenotype van de ontvangende muizen met beenmergtransplantatie aanzienlijk worden gewijzigd. Eind colitis experimenten, het beenmerg afgeleide cellen in bloed en beenmerg werden gemerkt met antilichamen tegen CD45.1 en CD45.2 en de kwantitatieve verhouding bestaan ​​kunnen worden gebruikt om het succes van beenmergtransplantatie door flowcytometrie evalueren. Succesvolle beenmergtransplantatie moeten tonen een grote meerderheid van de donor genotype (in termen van CD molecule marker) over de ontvanger genotype in zowel het beenmerg en het bloed van de ontvanger muizen.

Protocol

1. Before-you-start Technische overwegingen Wij raden u aan zowel C57/BL6 wild-type muizen en knock-out muizen voor experiment, omdat muizen met bijbehorende cd-moleculen kunnen worden gekocht bij de grote muis leveranciers. Aangezien het moeilijk op te sporen het wild-type muizen en knockout muizen afgeleide donorcellen na beenmergtransplantatie, moet CD45.1 muizen gebruiken om wild-type muizen vertegenwoordigen. (CD45.1 C57/SJL WT muizen Jackson Laboratories voorraad # 002014). De meeste…

Representative Results

Als het gen-van-belang speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem cellen tijdens de ontwikkeling van colitis, de muizen die beenmerg van verschillende genotype door beenmergtransplantatie (WT KO KO of om WT) moet een veranderde reactie op DSS colitis. Een van de belangrijkste parameters voor het bepalen van de ernst van colitis is de H & E kleuring van de colon weefsel. Colonic weefselstructuur veranderingen en tekenen van ontsteking kan kwantitatief worden geëvalueerd door H & E histologie scoresysteem. C…

Discussion

Deze beenmergtransplantatie aanpak is geschikt voor immunologie van colitis, infecties, kanker, obesitas en andere aandoeningen. Dit experiment beenmergtransplantatie nodig wanneer het gen-van-belang wordt uitgedrukt in beide afgeleid beenmerg en niet-beenmerg afgeleide cellen en het gen-van-belang vermoedelijk ziekte bemiddelen door cellen van beide populatie. Bijvoorbeeld, antimicrobiële peptide cathelicidine aangetoond moduleren acute colitis. Maar wordt uitgedrukt in zowel epitheelcellen en immuuncellen (zoals macr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door Pilot en haalbaarheidsstudie subsidie ​​van UCLA-CURE Center, de ziekte van Crohn en Colitis Foundation of America Career Development Award (# 2691) en National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) financiering van Hon Wai Koon.

Beenmerg bestraling operatie werd bijgestaan ​​door Bernard Levin en Scott Keuken van UCLA Center for AIDS Research muis / humaan Chimera Core faciliteit. Flowcytometrie operatie werd bijgestaan ​​door UCLA Vector Core faciliteit.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Cell staining buffer Biolegend #420201
10X RBC lysis buffer Biolegend #420301
FITC mouse isotype control Biolegend #400207
PE mouse isotype control Biolegend #400211
PE anti-mouse CD45.2 Biolegend #109807
FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend #110705
Anti-mouse CD16/32 blocking Biolegend #101301
40 μm cell strainer Fisherbrand #22363547
PBS 1X MP biomedicals #1860454
Heparin Fisherbrand #BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (fisher)
Lysol IC Andwin Scientific NC9745686 (fisher)
Vaccutainer BD #8000813
Mouse restrainer Braintree Scientific #TV-150
Irradiator J.L. Shepherd and Associates Mark I 68A
Flow cytometer BD BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube Falcon #352052
Digital caliper Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult ICT Beckman Coulter G0328QW

References

  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
  3. Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
  4. Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
  5. Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
  6. Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
  7. Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
  8. Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
  9. Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
  10. Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
  11. Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
  12. Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
  13. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
  14. Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).

Play Video

Cite This Article
Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation. J. Vis. Exp. (68), e4208, doi:10.3791/4208 (2012).

View Video