Um método para a purificação em larga escala do domínio intracelular de APP (AICD) é descrita. Nós também descrevem metodologia de indução<em> In vitro</em> Agregação AICD e visualização por microscopia de força atômica. Os métodos descritos são úteis para a caracterização bioquímica / estrutural da AICD e os efeitos das chaperones moleculares sobre a sua agregação.
Proteína precursora amilóide (APP) é uma proteína transmembranar de tipo I associado à patogénese da doença de Alzheimer (AD). APP é caracterizada por um grande domínio extracelular e um domínio citosólico curto denominado o domínio intracelular de APP (AICD). Durante a maturação através da via secretora, APP pode ser clivada por proteases denominadas α, β e γ-secretases 1. A clivagem proteolítica da APP sequencial com β e γ-secretases conduz à produção de um péptido pequeno proteolítico, denominado de Ap, que é amiloidogénica e o constituinte principal das placas senis. A AICD também é libertada a partir da membrana, após o processamento secretase, e por meio de interacções com Fe65 e Tip60, pode translocar para o núcleo para participar na regulação da transcrição de genes alvo múltiplas 2,3. Interacções proteína-proteína envolvendo a AICD podem afectar o tráfico, o processamento e as funções celulares de holo-APP e seus C-terminfragmentos al. Mostrámos recentemente que AICD pode agregar in vitro, e este processo é inibido pelo ubiquilin-1-AD implicado chaperone molecular 4. Consistente com estes resultados, a AICD expôs domínios hidrofóbicos e está intrinsecamente desordenados in vitro 5,6, no entanto, obtém estrutura secundária estável quando ligado ao Fe65 7. Propusemos que ubiquilin-1 impede inadequado interacções inter-e intramolecular da AICD, prevenindo a agregação in vitro e em células intactas 4. Enquanto a maioria dos estudos focado o papel de APP na patogénese de AD, o papel da AICD neste processo não são claras. Expressão da AICD foi mostrado para induzir a apoptose 8, para modular as vias de sinalização 9, e para regular a sinalização de cálcio 10. A sobre-expressão da AICD e Fe65 num modelo de ratinho transgénico induz patologia de Alzheimer, como 11, e recentemente AICD foi detectado no braem lisados por western blotting quando usando técnicas de recuperação de antigénios apropriados 12. Para facilitar os estudos estruturais, bioquímicas e biofísicas da AICD, desenvolvemos um procedimento para a produção de quantidades grandes de forma recombinante altamente pura proteína AICD. Iremos descrever um método para a indução in vitro da agregação térmica da AICD e análise por microscopia de força atómica. Os métodos descritos são úteis para a caracterização bioquímica, biofísica e estrutural da AICD e os efeitos das chaperones moleculares na agregação AICD.
Neste protocolo temos delineado um procedimento para obter AICD altamente puro para análises estruturais, biofísicos e bioquímicos. Este procedimento não requer equipamento sofisticado cromatografia e é, portanto, acessível para a maioria dos laboratórios. Outros grupos têm purificada AICD 5-7,16, incluindo GST-AICD 17-19, para as análises bioquímicas / estrutural. Desvantagens aos protocolos anteriores incluem fraca solubilidade do AICD 16, menos do que ideal pureza 17,</…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) para a APP cDNA. Este trabalho foi financiado pelo NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), o John Sealy Memorial Fund Endowment for Biomedical Research (AFO), e Jean C. e D. William Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB é um estudioso do Programa de Pesquisa Translacional Scholar e membro da Universidade do Texas Medical Sucursal Claude E. Pimenta antiga americanos Independência Centro (apoiado pelo NIH UL1RR029876 e P30-AG-024832, respectivamente).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |