Un metodo per la grande purificazione del dominio intracellulare APP (AICD) è descritto. Abbiamo anche descrivere la metodologia di indurre<em> In vitro</em> AICD aggregazione e visualizzazione mediante microscopia a forza atomica. I metodi descritti sono utili per la caratterizzazione biochimica / strutturale del AICD e gli effetti di chaperone molecolare sulla sua aggregazione.
Proteina precursore dell'amiloide (APP) è un tipo di proteina transmembrana I associato alla patogenesi della malattia di Alzheimer (AD). APP è caratterizzata da un grande dominio extracellulare e un dominio breve citosolico chiamato il dominio intracellulare di APP (AICD). Durante la maturazione attraverso la via secretoria, APP può essere scissa dalla proteasi denominate α, β, e γ-secretasi 1. Sequenziale clivaggio proteolitico di APP con β e γ-secretasi porta alla produzione di un peptide piccolo proteolitico, Ap definito, che è amiloidogena e il componente principale delle placche senili. L'AICD è liberata dalla membrana dopo trasformazione secretasi, e attraverso interazioni con Fe65 e Tip60, può traslocare al nucleo di partecipare nella regolazione della trascrizione di geni bersaglio più 2,3. Proteina-proteina interazioni che coinvolgono il AICD può influenzare il traffico, l'elaborazione, e le funzioni cellulari di olo-APP e il suo C-terminaL frammenti. Abbiamo recentemente dimostrato che AICD può aggregare in vitro, e questo processo è inibito dalla AD-implicato chaperone molecolare ubiquilin-1 4. Coerentemente con questi risultati, il AICD ha esposto domini idrofobici ed è intrinsecamente disordinati in vitro 5,6, tuttavia ottiene stabile struttura secondaria quando si lega al Fe65 7. Abbiamo proposto che ubiquilin-1 impedisce appropriato interazioni inter e intramolecolari di AICD, impedendo l'aggregazione in vitro e in cellule intatte 4. Mentre la maggior parte degli studi si concentrano sul ruolo di APP nella patogenesi di AD, il ruolo di AICD in questo processo non è chiara. Espressione di AICD ha mostrato di indurre apoptosi 8, per modulare i percorsi di segnalazione 9 e di regolare il calcio segnalazione 10. Over-espressione di AICD e Fe65 in un modello di topo transgenico induce Alzheimer come patologia 11, e recentemente AICD è stato rilevato in reggisenonei lisati mediante Western blotting utilizzando appropriate tecniche di recupero di antigene 12. Per facilitare studi strutturali, biochimici e biofisici del AICD, abbiamo sviluppato una procedura per produrre quantità elevate di ricombinante altamente puro proteine AICD. Abbiamo inoltre descrivere un metodo per indurre l'aggregazione in vitro termica AICD e analisi mediante microscopia a forza atomica. I metodi descritti sono utili per la caratterizzazione biochimica, biofisica e strutturale del AICD e gli effetti di chaperone molecolare sull'aggregazione AICD.
In questo protocollo abbiamo delineato una procedura per ottenere AICD elevata purezza per analisi strutturali, biofisica e biochimica. Questa procedura non richiede attrezzature sofisticate cromatografia ed è quindi accessibile alla maggior parte dei laboratori. Altri gruppi hanno purificato AICD 5-7,16, compreso GST-AICD 17-19, per le analisi biochimiche / strutturale. Svantaggi ai protocolli precedenti includono scarsa solubilità di AICD 16, a meno di ideale purezza 17, e…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) per la APP cDNA. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), il John Sealy Memorial Fondo di dotazione per la ricerca biomedica (AFO), e il C. Jean e William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB è uno studioso nel Programma Translational Research Scholar e membro della University of Texas Medical Branch Claude E. Independence Pepper Centro anziani americani (supportato da sovvenzioni NIH UL1RR029876 e P30-AG-024832, rispettivamente).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |