ووصف طريقة لتنقية واسعة النطاق للمجال APP داخل الخلايا (AICD). وصفنا أيضا منهجية للحث<em> في المختبر</em> AICD التجميع والتصور بواسطة المجهر القوة الذرية. الأساليب المذكورة مفيدة لتوصيف البيوكيميائية / الهيكلية للAICD وآثار المحرمين الجزيئية على تجميع لها.
اميلويد السلائف البروتين (APP) هو نوع من البروتين عبر الغشاء I المرتبطة التسبب في مرض الزهايمر (AD). ويتميز APP بواسطة ملك خارج الخلية الكبيرة ومجال عصاري خلوي يسمى قصيرة المجال APP داخل الخلايا (AICD). خلال النضج من خلال مسار إفرازية، يمكن المشقوق APP بواسطة البروتياز وصف α، β، γ-secretases و1. انشقاق بروتين متسلسلة من APP مع β γ وsecretases-يؤدي إلى إنتاج بروتين الببتيد الصغيرة، ووصف Aβ، وهو amyloidogenic والمكونة الأساسية لويحات خرف. وAICD أيضا تتحرر من الغشاء بعد تجهيز secretase، ومن خلال التفاعل مع Fe65 وTip60، يمكن نقل من لنواة للمشاركة في تنظيم النسخ من الجينات المستهدفة متعددة 2،3. قد البروتين البروتين التفاعلات التي تنطوي على الاتجار تؤثر AICD، وتجهيز، والوظائف الخلوية من هولو-APP والخمسين C-ترمنشظايا آل. لقد أظهرنا مؤخرا التي يمكن الإجمالية في المختبر، وهذه العملية يتم من قبل AICD تحول دون ubiquilin-1 AD-المتورطين كوصي الجزيئية 4. بما يتفق مع هذه النتائج، AICD كشفت المجالات مسعور والمختلين جوهريا في المختبر 5،6، ومع ذلك فإنه يحصل هيكل مستقر الثانوية عندما يتجهون إلى Fe65 7. وقد اقترحنا أن ubiquilin-1 يمنع غير لائق التفاعلات بين وداخل الجزيء من AICD، ومنع تجميع في المختبر وخلايا سليمة في 4. في حين أن معظم الدراسات تركز على دور APP في التسبب في AD، ودور AICD في هذه العملية ليست واضحة. وقد تبين من التعبير للحث على موت الخلايا المبرمج AICD 8، لتعديل مسارات إشارات 9، وتنظيم الكالسيوم مما يشير 10. الإفراط في التعبير عن AICD وFe65 في نموذج الفأر المعدلة وراثيا يؤدي مثل علم الأمراض مرض الزهايمر 11، ومؤخرا تم الكشف عن AICD في البرازيللست] في غرب النشاف من قبل عند استخدام التقنيات المناسبة استرجاع مستضد 12. لتسهيل الدراسات الهيكلية، والكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية وللAICD، وقد وضعنا الداخلي لإنتاج كميات كبيرة من البروتين recombinantly AICD نقية للغاية. وصفنا طريقة أخرى لإحداث التجميع في المختبر الحراري للAICD والتحليل المجهري القوة الذرية. الأساليب المذكورة مفيدة لتوصيف الكيمياء الحيوية، والفيزياء الحيوية، والهيكلية للAICD وآثار المحرمين الجزيئية على تجميع AICD.
في هذا البروتوكول وقد أوجزنا في إجراءات الحصول على AICD نقية للغاية لتحليل الهيكلية، الفيزياء الحيوية، والكيمياء الحيوية. هذا الإجراء لا يتطلب معدات متطورة اللوني، وبالتالي الوصول إلى معظم المختبرات. طهروا مجموعات أخرى AICD 5-7،16، بما في ذلك GST-AICD 17-19، لتحالي?…
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور تشنغ هوى (كلية بايلور للطب) لAPP [كدنا]. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R21AG031948 (DB، JMB)، F30AG030878 (ESS)، R01DK073394 (AFO)، وسيلي جون صندوق الهبات التذكارية للبحوث الطبية الحيوية (AFO)، وجان وليم C. D. ويليس العلوم العصبية بحوث الوقف (ESS). JMB هو باحث في برنامج البحوث الباحث بالحركة وعضو في جامعة تكساس الطبية فرع كلود E. فلفل أقدم مركز الاستقلال الأميركيين (بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح UL1RR029876 وP30-AG-024832 على التوالي).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |