Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir temsil<em> Ex vivo</emMorfolojilerinden, farklılaşma ve büyüme gibi pankreas gelişiminin çeşitli yönlerini incelemek için> sistemi. Pankreatik tomurcuk eksplantlar birkaç gün boyunca kültürlendi ve bütün monte immunofloresans ve canlı görüntüleme de dahil olmak üzere farklı uygulama, bir dizi içinde kullanılabilir.
Pankreas sindirim enzimleri ve kan şekeri düzeylerini 1 düzenlenmesi üretimi dahil olmak üzere vücudun hayati fonksiyonları kontrol eder. Geçtiğimiz on yıl içinde birçok çalışma pankreas organogenez anlamak için sağlam bir temel katkıda bulunmuş olsa da, önemli boşluklar erken pankreas oluşumu 2 bilgimizi devam etmektedir. Bu erken olayların tam bir anlayış bu organın gelişimini içgörü sağlayabilir, ama aynı zamanda, diyabet veya pankreas kanseri gibi pankreas hedef tedavi edilemez hastalıklar, girer. Son olarak, bu bilgi diyabet kapsamında hücre-değiştirme tedavileri geliştirmek için bir şablon oluşturur.
Embriyo oluşumu sırasında, pankreas embriyonik gün dorsal ve ventral foregut endodermal fare embriyo 3,4 (E) 9,5 farklı embriyonik çıkıntılar meydana gelmektedir. Hem çıkıntılar sağlam epitel olarak çevredeki mezenşimi içine tersyüz etmektam olgun organı 2,5,6 oluşturmak için dallanma ve farklılaşması, proliferasyonu geçmesi l tomurcukları. Son bulgular insülin üreten β-hücreleri dahil olmak üzere pankreas hücre soylarının, büyüme ve farklılaşma dallanma pankreas epiteli 7,8 içinde uygun doku mimarisi, epitel şekillenmesi ve hücre konumlandırma bağlıdır ileri sürmüşlerdir. Ancak, morfolojilerinden dallanma nasıl oluşur ve pankreasta proliferasyon ve farklılaşma ile koordine edilir ölçüde bilinmemektedir. Bu morfogenetik olaylar son derece dinamik ise bu gelişim süreçleri hakkında güncel bilgi, sabit numunelerinin analizi neredeyse sadece güvendi olması nedeniyle kısmen olduğunu.
Burada, diseksiyon ve gelişmekte olan pankreas (Şekil 1) doğrudan görüntülenmesine izin cam alt yemekleri hakkında kültürleme fare embriyonik pankreas tomurcukları ex vivo için bir yöntem sunulmuştur. Bu külture sistemi ideal Özellikle, canlı hücre görüntüleme, konfokal lazer tarama mikroskopi için tasarlanmış ve. Pankreatik eksplantlar, sadece yabani-tip fare embriyolarından hazırlanmış, fakat, aynı zamanda genetik mühendisliği fare suşu (örneğin, transgenik veya nakavt) için, mutant fenotipleri gerçek zamanlı çalışmalar sağlayan edilebilir. Dahası, bu ex vivo kültür sistemi çoğalması ve büyümesi, uzama, dallanma, tubulogenesis ve farklılaşması ile ilgili nicel veriler elde etmek sağlayan, pankreas gelişimi üzerinde kimyasal bileşiklerin etkilerini incelemek için değerlidir. Sonuç olarak, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile kombine bir ex vivo pankreas eksplant kültür yöntemi geliştirilmesi de gelişmekte olan fare embryo içinde meydana gibi morfogenetik ve farklılaşma olayları gözlemlemek için güçlü bir platform sağlar.
Pankreas kaderi belirtildiğinde sonra, pankreas progenitör hücreler sonunda olgun ve fonksiyonel bir organdır 2,4 oluşturmak için kapsamlı çoğalma, farklılaşma ve morfonogenezi tabi. Şu anda, dallanma nasıl pankreas yer alır ve nasıl progenitör çoğalması ve farklılaşması bağlı büyük ölçüde bilinmemektedir. Pankreas eksplant kültürleri bu süreçlerin ex vivo 5,9,11 aydınlatmak için ideal bir sistem temsil eder. Erken pankreas tomurcukları ex vivo …
The authors have nothing to disclose.
Araştırma Spagnoli lab. Helmholtz Topluluğu, FP7-IRG-2008-ENDOPANC hibe ve ERC-2009-Başlangıç HEPATOPANCREATIC Grant tarafından finanse edilmektedir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
Watchmaker’s foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |