نظام ل<em> خارج الجسم</em> التثقيف البنكرياس الجنينية

Summary

هنا، نحن تصف طريقة للثقافة والعزلة والتلاعب في البنكرياس الماوس الجنينية. هذا يمثل ممتاز<em> خارج الجسم</em> نظام لدراسة مختلف جوانب التنمية البنكرياس، بما في ذلك التمايز، التشكل والنمو. يمكن تربيتها إإكسبلنتس برعم البنكرياس لعدة أيام واستخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات المختلفة، بما في ذلك كله جبل المناعي والتصوير الحي.

Abstract

البنكرياس تسيطر الوظائف الحيوية من الجسم، بما في ذلك إنتاج الإنزيمات الهضمية وتنظيم مستويات السكر في الدم ^1. رغم أنه في العقد الماضي العديد من الدراسات قد ساهمت في أساس متين لفهم توالد الأعضاء البنكرياس، ثغرات هامة لا تزال قائمة في معرفتنا تشكيل البنكرياس في وقت مبكر ^2. وهناك فهم كامل لهذه الأحداث في وقت مبكر توفير نظرة ثاقبة على تطوير هذا الجهاز، ولكن أيضا في الأمراض المستعصية التي تستهدف البنكرياس، مثل مرض السكري أو سرطان البنكرياس. وأخيرا، فإن هذه المعلومات تولد مخططا لتطوير علاجات استبدال الخلايا في سياق مرض السكري.

خلال مرحلة التطور الجنيني، والبنكرياس تنبع من الامتداد الجنينية متميزة من الأديم الباطن المعى الأمامي الظهري البطني في اليوم والجنينية (E) 9.5 في جنين فأر ^3،4. كلا الامتداد evaginate في اللحمة المتوسطة المحيطة بها ظهائر الصلبةبراعم لتر، التي تخضع الانتشار، المتفرعة والتمايز لإنشاء هيئة ناضجة تماما ^2،5،6. وقد اقترح مؤخرا أن الأدلة نمو وتمايز الخلايا البنكرياسية الأنساب، بما في ذلك الخلايا المنتجة للانسولين β، ويعتمد على إعادة عرض مناسب، والأنسجة الطلائية العمارة وتحديد المواقع داخل الخلية ظهارة البنكرياس المتفرعة ^7،8. ولكن، كيف يحدث المتفرعة التشكل والانتشار وبالتنسيق مع التمايز في البنكرياس غير معروفة إلى حد كبير. هذا هو في جزء منه يرجع ذلك إلى حقيقة أن المعرفة الحالية حول هذه العمليات التنموية اعتمدت بشكل حصري تقريبا على تحليل العينات الثابتة، في حين الأحداث تخلقية حيوية للغاية.

هنا، ونحن التقرير وسيلة لتشريح وزراعة الماوس الجنينية السابقين فيفو براعم البنكرياس على أطباق أسفل الزجاج، والتي تسمح رؤية مباشرة من البنكرياس النامية (الشكل 1). هذا عبادةوضعت بشكل مثالي لدى عودتهم نظام ليزر متحد البؤر المجهري المسح، ولا سيما التصوير الخلية الحية. يمكن إعداد إإكسبلنتس البنكرياس ليس فقط من أجنة الفئران البرية من نوع، ولكن أيضا من سلالات الفئران المعدلة وراثيا (جينيا أو مثل خروج المغلوب)، مما يسمح في الوقت الحقيقي من الدراسات الظواهر متحولة. وعلاوة على ذلك، هذه الثقافة الحية النظام السابق قيمة لدراسة آثار المركبات الكيميائية على التنمية البنكرياس، مما يتيح الحصول على بيانات كمية عن الانتشار والنمو، واستطالة، المتفرعة، tubulogenesis والتمايز. في الختام، وضع البنكرياس المجراة سابقا أسلوب الثقافة يزدرع جنبا إلى جنب مع التصوير عالية الدقة توفر منصة قوية لمراقبة تخلقية والتمايز الأحداث حال وقوعها داخل جنين فأر النامية.

Protocol

وقد تم تكييف البروتوكول الموصوفة هنا من تقنية صفها أصلا في بيرسيفال وسلاك 9 و الأمثل للفحص المجهري متحد البؤر. 1. طلاء الزجاج من الأطباق الاستزراع القاعي وينبغي إجراء الخطوات الآتية تحت ظ…

Discussion

مرة واحدة يتم تحديد مصير البنكرياس، الخلايا الاصلية البنكرياس الخضوع انتشار واسعة، والتمايز والتشكل في نهاية المطاف لتشكيل هيئة ناضجة وظيفية ^2،4. في الوقت الحاضر، وكيف المتفرعة يحدث في البنكرياس وكيف يتم توصيله انتشار السلف والتمايز غير معروف إلى حد كبير. يزد?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1