Ein System für<em> Ex vivo</em> Kultivierung von embryonalen Pankreas

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine hervorragende<em> Ex vivo</em> System zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Bauchspeicheldrüse Entwicklung, einschließlich der Morphogenese, Differenzierung und Wachstum. Pankreas Knospe Explantate kann für mehrere Tage kultiviert werden und in einer Reihe von verschiedenen Anwendungen, einschließlich whole-mount Immunfluoreszenz und Live-Bildgebung.

Abstract

Die Bauchspeicheldrüse steuert wichtige Funktionen unseres Körpers, einschließlich der Produktion von Verdauungsenzymen und Regulierung des Blutzuckerspiegels ^1. Obwohl in den letzten zehn Jahren viele Studien zu einer festen Grundlage für das Verständnis der Bauchspeicheldrüse Organogenese beigetragen haben, bestehen große Lücken in unserem Wissen über frühe Bauchspeicheldrüse Bildung ^2. Ein vollständiges Verständnis dieser frühen Ereignisse Einblick in die Entwicklung dieses Organs zu schaffen, sondern auch in unheilbaren Krankheiten, die die Bauchspeicheldrüse zielen, wie Diabetes oder Bauchspeicheldrüsenkrebs. Schließlich werden diese Informationen generieren Konzept für die Entwicklung Zell-Ersatz-Therapien im Rahmen des Diabetes.

Während der Embryogenese, stammt die Bauchspeicheldrüse aus unterschiedlichen embryonalen Auswüchse der dorsalen und ventralen foregut Endoderm am embryonalen Tag (E) 9,5 im Maus-Embryo ^3,4. Beide Auswüchse evaginate in das umgebende Mesenchym als feste Epithelienl Knospen, die Proliferation unterziehen, Verzweigung und Differenzierung eine ausgereifte Orgel ^2,5,6 generieren. Jüngste Beweise haben vorgeschlagen, dass das Wachstum und die Differenzierung von Pankreas-Zelllinien, einschließlich der Insulin produzierenden β-Zellen, auf ordnungsgemäße gewebespezifischen Architektur, epitheliale Zelle Remodellierung und Positionierung innerhalb des Pankreas Epithel Verzweigungsmittel ^7,8 abhängt. Doch wie Verzweigungen Morphogenese auftritt und mit der Proliferation und Differenzierung in der Bauchspeicheldrüse koordiniert ist weitgehend unbekannt. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass die derzeitigen Wissen über diese Entwicklungsprozesse bisher fast ausschließlich auf der Analyse von festen Proben herangezogen, während morphogenetischen Ereignisse hochdynamisch sind.

Hier berichten wir über eine Methode zum Präparieren und Kultivieren von embryonalen Maus-Pankreas Knospen ex vivo am Glasboden Gerichte, die direkte Visualisierung der Entwicklung von Pankreas (Abbildung 1) zu ermöglichen. Dieser Kulture-System ist ideal für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie entwickelt und vor allem Live-Cell-Imaging. Pancreatic Explantate können nicht nur von Wildtyp-Maus-Embryonen hergestellt werden, sondern auch aus gentechnisch veränderten Mauslinien (zB transgenen oder Knockout), so dass Echtzeit-Studien von mutierten Phänotypen. Darüber hinaus ist diese ex vivo Kultursystem wertvolle um die Wirkungen von chemischen Verbindungen auf Bauchspeicheldrüsenentwicklung studieren, ermöglicht, um quantitative Daten über die Proliferation und das Wachstum, die Dehnung, Verzweigungsgrad, Tubulogenese und Differenzierung zu erreichen. Zusammenfassend stellt die Entwicklung eines ex vivo Pankreas Explantatkultur Methode mit hochauflösenden bildgebenden kombiniert eine starke Plattform für die Beobachtung morphogenetischen und Differenzierung Ereignisse, wie sie in den Entwicklungsländern Maus-Embryo auftreten.

Protocol

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Technik, die ursprünglich in Percival und Slack 9 beschrieben und optimiert für die konfokale Mikroskopie angepasst. Ein. Beschichtung von Glass Bottom Kultur Dishes Die folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt werden. Pancreatic Explantate werden in 35-mm-Petrischalen mit 20-mm Durchmesser Glas Mikrowell Boden (zB MatTek Corporation) kult…

Discussion

Sobald pankreatischen Schicksal angegeben, durchlaufen Pankreas-Vorläuferzellen umfangreiche Proliferation, Differenzierung und Morphogenese zu bilden schließlich ein reifes und funktionalen Organs ^2,4. Derzeit dauert, wie Verzweigen in der Bauchspeicheldrüse und wie es um Vorläuferzellen Proliferation und Differenzierung verbunden ist weitgehend unbekannt. Pancreatic Explantatkulturen stellen ein ideales System zur Aufklärung dieser Prozesse ex vivo ^5,9,11. Durch die Kombination von …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker’s foreceps Dumont #5	Roth	K342.1